تفاعل الپوليمريز المتسلسل

عودة للموسوعة

تفاعل الپوليمريز المتسلسل

أنابيب بلاستيكية يحوي جميع منها على 100μl من مزيج تفاعل PCR

تفاعل الپوليمريز المتسلسل بالإنگليزية: Polymerase chain reaction واختصاره PCR. هي عملية حيوية تهدف بالأساس لزيادة كمية الدنا الموجودة. تتم هذه العملية بصنع خليط من: دنا العينة، والإنزيمات، والنيوكليوتيدات والمشرعات وبعض المحاليل الأخرى بتراكيز مختلفة. ثم توضع في جهاز يقوم تلقائيا بحمل درجة الحرارة وخفضها، وتكرار العملية تباعاً؛ حتى الوصول إلى هجريز أكبر من الدنا. وهومن الطرائق الهامة والشائعة في البيولوجيا الجزيئية المعاصرة. اتى اسمه من أحد مكوناته، وهوإنزيم پوليمريز الـDNA المستعمل في التنسُّخ الإنزيمي للـDNA. خلال التفاعل يخدم DNA مرصافاً لنفسه، فيحدث تفاعل تسلسلي حين تتضاعف كمية المرصاف وسرعة التفاعل مع جميع طور، مما يسمح بالحصول على ملايين النسخ من سلسلة DNA خلال فترة وجيزة لتحليله.

تفاعل البوليميراز المتسلسل ( PCR ) هوكيفية تستخدم على نطاق واسع لجعل الملايين إلى مليارات النسخ من عينة معينة من الدنا بسرعة ، مما يسمح للفهماء بأخذ عينة صغيرة جدًا من الحمض النووي وتضخيمها إلى كمية كبيرة بما يكفي للدراسة بالتفصيل. تم اختراع ال PCR في عام 1984 من قبل الكيميائي الحيوي الأمريكي كاري موليس في شركة سيتوس . إنه أساسي لكثير من الاختبارات الجينية بما في ذلك تحليل العينات القديمة من الدنا وتحديد العوامل المعدية. باستخدام ال PCR ، يتم تضخيم نسخ كميات صغيرة جدًا من تسلسلات الحمض النووي بشكل كبير في سلسلة من دورات تغيرات درجة الحرارة. ال PCR هوالآن أسلوب رائج ولا غنى عنه في كثير من الأحيان يستخدم في المختبرات الطبية والبحوث المخبرية السريرية لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك البحوث الطبية الحيوية والطب الشرعي الجنائي.


تعتمد غالبية طرق ال PCR على التدوير الحراري . تعرض الدورة الحرارية المواد المتفاعلة لدورات متكررة من التدفئة والتبريد للسماح بتفاعلات مختلفة تعتمد على درجة الحرارة - على وجه التحديد ، انصهار الدنا وتناسخ الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين المتحكم عن طريق الإنزيم . يستخدم PCR كاشفين رئيسيين - المشرعات (وهي تعبير عن بتر شريط الدنا قصير واحد يعهد باسم قليل النوكليوتيد الذي هوتسلسل مكمل لمنطقة الدنا المستهدفة) وبوليميراز الدنا . في المستوى الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم فصل شريطي الحلزون المزدوج للحمض النووي مادياً عند درجة حرارة عالية في عملية تسمى إفساد الدنا . في المستوى الثانية ، تنخفض درجة الحرارة وترتبط المشرعات بالتسلسلات التكميلية للدنا. ثم أصبحت شرائط الدنا اثنين من القوالب لبلمرة الدنا إلى إنزيمي تجميع شريط الدنا الجديد من النيوكليوتيدات الحرة ، لبنات جزيئات الدنا. مع تقدم ال PCR ، يتم استخدام الدنا المولّد نفسه كنطقب للنسخ المتماثل ، مما يؤدي إلى تنشيط تفاعل تسلسلي يتم فيه تضخيم نطقب الدنا الأصلي بشكل كبير .

تستخدم جميع تطبيقات ال PCR تقريبًا بوليميراز الدنا المستقر بالحرارة ، مثل پوليمريز المستحرة المائية ، وهوإنزيم معزول في الأصل عن البكتيريا المحبة للحرارة المستحرة المائية . إذا كانت البلمرة المستخدمة عرضة للحرارة ، فسوف ينجرف تحت درجات الحرارة العالية لخطوة التمسخ. قبل استخدام پوليمريز المستحرة المائية ، كان يجب إضافة بوليميراز الدنا يدويًا في جميع دورة ، والتي كانت عملية شاقة ومكلفة.

تضم تطبيقات التقنية استنساخ الدنا من أجل التسلسل ، واستنساخ الجينات ومعالجتها ، وتطفير الجينات ؛ بناء شجرة المحتد المستندة إلى الدنا، أوالتحليل الوظيفي للجينات ؛ تشخيص ورصد الأمراض الوراثية ؛ تضخيم الحمض النووي القديم ; تحليل البصمات الوراثية لتنميط الدنا (على سبيل المثال ، في فهم الطب الشرعي واختبار النسب ) ؛ والكشف عن الممراض في اختبارات الدنا لتشخيص الأمراض المعدية

وضع شريط من ثمانية أنابيب PCR في مدور حراري

مبادئ PCR وطريقة الإجراء

جهاز مدور حراري لـ PCR
جهاز تدوير حراري أقدم بثلاث درجات حرارة لـ PCR

يضخم ال PCR منطقة معينة من شريط الدنا (الدنا المستهدف). تضخم معظم طرق PCR اجزاء الدنا التي يتراوح طولها بين 0.1 وعشرة كيلوزوج قاعدي (kbp) ، على الرغم من حتى بعض التقنيات تسمح بتضخيم اجزاء تصل إلى 40 كيلوزوج قاعدي kbp . يتم تحديد كمية المنتج المضخم بواسطة الركائز المتاحة في التفاعل ، والتي تصبح محدودة مع تقدم التفاعل .

يتطلب إعداد ال PCR الأساسي الكثير من المكونات والكواشف , بما في ذلك:

  • نطقب DNA يحتوي على منطقة الدنا المستهدفة لتضخيمها
  • بوليميراز الدنا . إنزيم بلمرة شرائط دنا جديدة ؛ پوليمريز المستحرة المائية المقاوم للحرارة رائج بشكل خاص, لأنه من المرجح حتى يظل سليماً أثناء عملية إفساد الدنا ذات درجة الحرارة العالية
  • اثنين من المشرعات الدنا المتممة للنهايات ثلاثة '' (ثلاث مراحل رئيسية) لكل من نهاية نفس الاتجاة اوالاتجاه المعاكس لشرائط الحمض النووي المستهدف (يمكن حتى يرتبط بوليميراز الحمض النووي ويستطيل فقط من منطقة الشرائط المزدوجة من الحمض النووي ؛ بدون مشرع هناك لا يوجد مسقط بدء مزدوج الشرائط حيث يمكن حتى يرتبط البوليميراز) يتم اختيار المشرعات المحددة المكملة للمنطقة المستهدفة للدنا مسبقًا ، وغالبًا ما يتم تصنيعها بشكل مخصص في المختبر أوشراؤها من موردي الكيمياء الحيوية التجاريين
  • دي أوكسي نيوكليوزيد ثلاثي الفوسفات ، أوdNTPs (يسمى أحيانًا "دي أوكسي نيوكليوتايد ثلاثي الفوسفات" ؛ النيوكليوتيدات التي تحتوي على مجموعات ثلاثي الفوسفات) ، وهي اللبنات التي يقوم منها بوليميراز الدنا بتوليف شريط دنا جديد
  • محلول منظم يوفر بيئة كيميائية مناسبة للنشاط الأمثل والاستقرار لبوليميراز الدنا
  • الهوابط ثنائية التكافؤ ، عادة أيونات المغنيسيوم (Mg) أوالمنجنيز (Mn) ؛ Mg 2+ هوالأكثر شيوعًا ، ولكن يمكن استعمال Mn 2+ في الطفرات الوراثية للوسيط بواسطة ال PCR ، حيث يزيد الهجريز Mn 2+ الأعلى من معدل الخطأ أثناء تخليق الدنا والهوابط أحادية التكافؤ ، أيونات البوتاسيوم (K)

عادة ما يتم التفاعل في حجم 10-200 ميكرولتر في أنابيب التفاعل الصغيرة (0.2-0.5   مل الأحجام) في المدورالحراري . يقوم المدور الحراري بتسخين وتبريد أنابيب التفاعل لتحقيق درجات الحرارة المطلوبة في جميع خطوة من خطوات التفاعل (انظر أدناه). تستخدم الكثير من أجهزة التدوير الحرارية الحديثة تأثير بلتيير ، الذي يسمح بتسخين وتبريد الكتلة التي تمسك أنابيب ال PCR ببساطة عن طريق عكس التيار الكهربائي. تسمح أنابيب التفاعل ذات الجدران الرقيقة بالتوصيل الحراري المناسب للسماح بالموازنة الحرارية السريعة. تحتوي معظم أجهزة التدوير الحرارية على أغطية ساخنة لمنع التكثف في الجزء العلوي من أنبوب التفاعل. تتطلب أجهزة التدوير الحرارية القديمة التي تفتقر إلى غطاء ساخن طبقة من الزيت فوق خليط التفاعل أوكرة من الشمع داخل الأنبوب.


الاجراء

رسم تخطيطي لدورة تفاعل الپوليمريز المتسلسل. (1) إفساد عند 94-96 درجة مئوية. (2) التلدين عند 65 درجة مئوية تقريبًا (3) استطالة عند 72 درجة مئوية. تظهر أربع دورات هنا. تمثل الخطوط الزرقاء نطقب DNA الذي تصل إليه البادئات (الأسهم الحمراء) التي يتم تمديدها بواسطة DNA الپوليمريز (دوائر خضراء فاتحة) ، لإعطاء منتجات DNA أقصر (خطوط خضراء) ، والتي تستخدم نفسها كقوالب مع تقدم تفاعل الپوليمريز المتسلسل.

عادة ، يتكون ال PCR من سلسلة من 20-40 تغيرات متكررة في درجة الحرارة ، تسمى الدورات الحرارية ، وتتكون جميع دورة بشكل رائج من خطوتين أوثلاث درجات حرارة منفصلة (انظر الشكل أدناه). غالبًا ما يسبق التدوير خطوة درجة حرارة واحدة عند درجة حرارة عالية جدًا (> 90 °م (194 °ف) ، ويتبعها تعليق واحد في النهاية للتمديد النهائي للمنتج أوالتخزين القصير. تعتمد درجات الحرارة المستخدمة وطول المدة التي يتم تطبيقها فيها في جميع دورة على مجموعة متنوعة من المتثابتات ، بما في ذلك الإنزيم المستخدم في تخليق الدنا ، وهجريز الأيونات ثنائية التكافؤ وdNTPs في التفاعل ، ودرجة حرارة الانصهار ( T m )للمشرعات. المراحل الفردية الشائعة لمعظم طرق PCR هي كما يلي:

  • التهيئة : هذه المستوى مطلوبة فقط لبوليمرات الدنا التي تتطلب التنشيط الحراري بواسطة PCR البادئ .وتتكون من تسخين غرفة التفاعل إلى درجة حرارة 94–96 °م (201–205 °ف) ، أو98 °م (208 °ف) إذا تم استخدام بلمرات شديدة الحرارة ، يتم الاحتفاظ بها بعد ذلك لمدة 1-10 دقائق.
  • الإفساد: هذه المستوى هي أول دورة تدوير منتظمة وتتكون من تسخين غرفة التفاعل إلى 94–98 °م (201–208 °ف) لمدة 20-30 ثانية. يؤدي هذا إلى ذوبان الدنا ، أوإفساد ، من نطقب الدنا مزدوج الشرائط عن طريق كسر روابط الهيدروجين بين القواعد التكميلية ، مما ينتج جزيئين من الدنا أحادي الشريط.
  • التلدين : في المستوى التالية ، تنخفض درجة حرارة التفاعل إلى 50–65 °م (122–149 °ف) لمدة 20-40 ثانية ، مما يسمح بتلديين المشرعات إلى جميع من قوالب الدنا أحادية الشريط. عادة ما يتم تضمين اثنين من المشرعات المتنوعة في خليط التفاعل: واحد لكل من المتممات الذين تبترت بهم السبل واحد يحتوي على المنطقة المستهدفة. المشرعات هي شرائط مفردة السلاسل نفسها ، ولكنها أقصر بكثير من طول المنطقة المستهدفة ، تكمل فقط تسلسلات قصيرة جدًا في نهاية ثلاثة 'من جميع شريط.
من الضروري تحديد درجة حرارة مناسبة لخطوة التلدين لأن الكفاءة والخصوصية تتأثر بشدة بدرجة حرارة التلدين. يجب حتى تكون درجة الحرارة هذه منخفضة بما يكفي للسماح بتهجين المشرع إلى الشريط ، ولكنها مرتفعة بما يكفي ليكون التهجين محددًا ، أي يجب حتى يرتبط المشرع فقط بجزء مكمل تمامًا من الشريط ، وليس في أي مكان آخر. إذا كانت درجة الحرارة منخفضة جدًا ، فقد يحدث المشرع غير كامل. إذا كانت عالية جدًا ، فقد لا يلتصق المشرع على الإطلاق. تبلغ درجة حرارة التلدين النموذجية حوالي 3-5   ° C أقل من درجة الانصهار م من المشرعات المستخدمة. لا تتكون روابط الهيدروجين المستقرة بين القواعد التكميلية إلا عندما يتطابق تسلسل المشرع مع تسلسل النطقب. خلال هذه المستوى ، يرتبط البلمرة بالهجين النطقب المشرع ويبدأ في تكوين الدنا
  • التمديد / الاستطالة : تعتمد درجة الحرارة في هذه المستوى على بوليميراز الدنا المستخدم ؛ درجة حرارة النشاط المثلى لبوليميراز الدنا للحرارة من البلمرة پوليمريز المستحرة المائية حوالي 75–80 °م (167–176 °ف) علي الرغم من ان درجة حرارة 72 °م (162 °ف) شائعة الاستخدام مع هذا الإنزيم. في هذه المستوى ، يقوم بوليميراز الدنا بتكوين شريط الدنا حديث مكمل لشريط نطقب الدنا عن طريق إضافة dNTPs حرة من خليط التفاعل المكمّل للنطقب في الاتجاه منخمسة إلى ثلاثة ، مما يكثف مجموعة 5'- الفوسفات من dNTPs مع مجموعة 3'- هيدروكسي في نهاية شريط الدنا الوليد (الممدود). يعتمد الوقت الدقيق المطلوب للاستطالة على بوليميراز الدنا المستخدم وعلى طول المنطقة المستهدفة في الدنا لتضخيمها. كقاعدة عامة ، عند درجة الحرارة المثلى ، تبلمر معظم بلمرة الدنا ألف قاعدة في الدقيقة. في ظل الظروف المثلى (على سبيل المثال ، إذا لم تكن هناك قيود بسبب الحد من الركائز أوالكواشف) ، في جميع خطوة تمديد / استطالة ، يتم مضاعفة عدد التسلسلات المستهدفة للدنا. مع جميع دورة متتالية ، تصبح شرائط النطقب الأصلية بالإضافة إلى جميع الشرائط التي تم إنشاؤها حديثًا شرائط نطقب للجولة التالية من الاستطالة ، مما يؤدي إلى تضخيم أسي (هندسي) لمنطقة الحمض النووي المستهدفة المحددة.
  • تشكل عمليات الإفساد والتمديد والتصليب دورة واحدة. تحصل الدورات المتعددة عندما يستوجب تضخيم منطقة الدنا المستهدفة إلى ملايين النسخ. الصيغة المستخدمة لحساب عدد نسخ الدنا المتشكلة بعد عدد معين من الدورات هي 2n، حيث n هوعدد الدورات. ومن ثم فإن التفاعل الذي يحصل على 30 دورة ينتج عنه 230، أو1073741824، نسخة من منطقة الدنا ثنائي الشريط المستهدف.
  • الاستطالة النهائية : هذه المستوى الفردية اختيارية ، ولكن يتم تطبيقها عند درجة حرارة 70–74 °م (158–165 °ف) (نطاق درجة الحرارة المطلوب للنشاط الأمثل لمعظم البوليمرات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل) لمدة 5-15 دقيقة بعد دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل الأخيرة لضمان إطالة أي شريط دنا مفرد متبقي عالق بالكامل.
  • التعليق النهائي : المستوى الأخيرة تبرد غرفة التفاعل إلى 4–15 °م (39–59 °ف) لفترة غير محددة ، ويمكن استخدامها للتخزين قصير المدى لمنتجات ال PCR
منتجات تفاعل الپوليمريز المتسلسل المصبوغة ببروم إيثيديوم بعد الرحلان الكهربائي للهلام. تم استخدام مجموعتين من البادئات لتضخيم تسلسل هدف من ثلاث عينات نسيجية مختلفة. لا يوجد تضخيم في العينة رقم 1# ؛ تشير نطاقات الحمض النووي الريبوزي 2# ورقم 3# إلى تضخيم ناجح للتسلسل المستهدف. يُظهر الهلام أيضًا تحكمًا إيجابيًا وسلمًا يحتوي على أجزاء من الحمض النووي الريبوزي منقوص الاكسجين (DNA)محددة الطول لتحجيم النطاقات في تفاعلات الپوليمريز المتسلسل التجريبية.

للتحقق ما إذا كان ال PCR ولدت المتسقطة في منطقة الدنا المستهدفة بنجاح (كما يشار إليها أحيانا باسم المكبر أوأمبليكون )، الرحلان الكهربائي باستخدام جيل الأغاروز يمكن حتى تستخدم لفصل حجم المنتجات PCR. يتم تحديد حجم (أحجام) منتجات ال PCR عن طريق المقارنة مع سلم الدنا ، علامة الوزن الجزيئي التي تحتوي على أجزاء الدنا ذات الحجم المعروف التي تعمل على الجل إلى جانب منتجات PCR.


المراحل

كما هوالحال مع التفاعلات الكيميائية الأخرى ، يتأثر معدل التفاعل وكفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل بعوامل محددة. وبالتالي ، يمكن تقسيم عملية PCR بالكامل إلى ثلاث مراحل بناءً على تقدم التفاعل:

  • تضخيم أسي : في جميع دورة ، يتم مضاعفة كمية المنتج (بافتراض كفاءة رد عمل 100 ٪). بعد 30 دورة ، يمكن زيادة نسخة واحدة من الدنا حتى 1،000،000،000 (مليار) نسخة. بمعنى ما ، يتم التلاعب في تكرار سلسلة منفصلة من الدنا في أنبوب تحت ظروف خاضعة للرقابة. التفاعل حساس للغاية: يجب حتى تكون الكميات الدقيقة فقط من ادنا موجودة.
  • فترة التسوية : يتباطأ التفاعل مع فقدان بوليميراز الدنا للنشاط ، كما يؤدي استهلاك الكواشف ، مثل dNTPs والمشرعات ، إلى جعلها أكثر محدودية
  • الاستقرار: لا يتراكم المزيد من المنتجات بسبب استنفاد الكواشف والإنزيم.

التحسين

من الناحية العملية ، يمكن حتى يفشل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لأسباب مختلفة ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى حساسيته للتلوث مما يؤدي إلى تضخيم منتجات الدنا الزائفة. وبسبب هذا ، تم تطوير عدد من التقنيات والإجراءات لتحسين ظروف PCR يتم توجيه التلوث بالدنا الدخيل من خلال بروتوكولات وإجراءات المختبر التي تفصل مخاليط ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل من ملوثات الدنا المحتملة. يتضمن هذا عادةً الفصل المكاني لمناطق إعداد ال PCR من مناطق لتحليل أوتنقية منتجات PCR ، واستخدام المواد البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة ، وتنظيف سطح العمل تمامًا بين إعدادات التفاعل. تعتبر تقنيات التصميم التمهيدي مهمة في تحسين إنتاجية منتج ال PCR وتجنب تكوين منتجات زائفة ، ويمكن حتى يساعد استخدام مكونات العازلة البديلة أوإنزيمات البلمرة في تضخيم مناطق طويلة أوخلاف ذلك من الدنا. قد تؤدي إضافة الكواشف ، مثل فورماميد ، في الأنظمة العازلة إلى زيادة خصوصية وإنتاج ال PCR.يمكن إجراء المحاكاة الحاسوبية لنتائج PCR النظرية ( PCR الإلكترونية ) للمساعدة في تصميم المشرع.

الاستخدام

عزل الحمض النووي الانتقائي

يسمح PCR بعزل أجزاء الدنا من الدنا الجينومي من خلال التضخيم الانتقائي لمنطقة معينة من الدنا. يزيد هذا الاستخدام من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من عدة طرق ، مثل توليد مسبارات التهجين للتهجين الجنوبي أوالشمالي واستنساخ الدنا ، والتي تتطلب كميات أكبر من الدنا ، تمثل منطقة معينة من الدنا. يزود ال PCR هذه التقنيات بكميات كبيرة من الدنا النقي ، مما يتيح تحليل عينات الدنا حتى من كميات صغيرة جدًا من مادة البدء.

تتضمن التطبيقات الأخرى لـ PCR تسلسل الدنا لتحديد تسلسل مضخم PCR غير معروف حيث يمكن استعمال أحد مشرعات التضخيم في تسلسل Sanger ، وعزل تسلسل الدنا لتسريع تقنيات الحمض النووي المؤتلف التي تنطوي على إدخال تسلسل الدنا في البلازميد ، والعاثية ، أوكوزميد (حسب الحجم) أوالمادة الوراثية لكائن آخر. يمكن فحص المستعمرات البكتيرية (مثل الإشريشيا معوية ) بسرعة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل من أجل هجريب ناقلات الحمض النووي السليمة. يمكن أيضًا استخدام PCR للبصمات الوراثية ؛ تقنية الطب الشرعي المستخدمة لتحديد الشخص أوالكائن الحي من خلال مقارنة الحمض النووي التجريبي من خلال الأساليب المتنوعة القائمة على PCR.

تتمتع بعض طرق "بصمات الأصابع" في PCR بقوة تمييزية عالية ويمكن استخدامها لتحديد العلاقات الجينية بين الأفراد ، مثل الوالدين والطفل أوبين الأشقاء ، ويتم استخدامها في اختبار الأبوة (الشكل 4). يمكن استعمال هذه التقنية أيضًا لتحديد العلاقات التطورية بين الكائنات الحية عند استخدام ساعات جزيئية معينة (على سبيل المثال ، 16S rRNA وجينات recA للكائنات الحية الدقيقة.

الشكل 4: الرحلان الكهربائي للهلام لأجزاء الحمض النووي المضخم بواسطة تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR). (1) الأب. (2) الطفل. (3) الأم. لقد ورث الطفل بعض بصمات أصابع جميع والديه ، وليس كلها ، مما منحه بصمة جديدة وفريدة من نوعها.


تضخيم وتحديد الحمض النووي

لأن ال PCR يضخم مناطق الحمض النووي التي يستهدفها ، يمكن استعمال PCR لتحليل كميات صغيرة للغاية من العينة. هذا أمر بالغ الأهمية في كثير من الأحيان لتحليل الطب الشرعي ، عندما يتوفر فقط كمية ضئيلة من الحمض النووي كدليل. يمكن أيضًا استخدام PCR في تحليل الحمض النووي القديم الذي يعود تاريخه إلى عشرات الآلاف من السنين. تم استخدام هذه التقنيات المستندة إلى PCR بنجاح على الحيوانات ، مثل الماموث البالغ من العمر أربعين ألف عامًا ، وكذلك على الحمض النووي البشري ، في تطبيقات تتراوح من تحليل المومياوات المصرية إلى تحديد القيصر الروسي وجسم الملك الإنجليزي ريتشارد الثالث.

تسمح طرق PCR الكمي أوPCR بالزمن الحقيقي (qPCR)  , بعدم الخلط بينه وبين تفاعل البوليمراز المتسلسل للنسخ العكسي ) بتقدير كمية تسلسل معين موجود في العينة - وهي تقنية غالبًا ما يتم استخدامها لتحديد مستويات التعبير الجيني كمياً. ال PCR الكمي هوأداة راسخة لقياس كمية الحمض النووي التي تقيس تراكم منتج الحمض النووي بعد جميع جولة من تضخيم PCR.

يسمح qPCR بالتحديد الكمي لكشف تسلسل دنا معين وكشفه في الوقت العملي لأنه يقيس الهجريز أثناء عملية التوليف. هناك طريقتان للكشف المتزامن والقياس الكمي. تتكون الطريقة الأولى من استخدام الأصباغ الفلورية التي يتم الاحتفاظ بها بشكل غير محدد بين الشرائط المزدوجة. تشتمل الطريقة الثانية على مسبارات تقوم بتشفير تسلسلات محددة ويتم تمييزها بشكل فلوري. لا يمكن رؤية الكشف عن الحمض النووي باستخدام هذه الطرق إلا بعد تهجين المسبارات باستخدام الحمض النووي التكميلي. مزيج من التقنيات المثيرة للاهتمام هوPCR يالزمن الحقيقي والنسخ العكسي. تسمح هذه التقنية المتطورة ، المسماة RT-qPCR ، بتحديد كمية صغيرة من الرنا. من خلال هذه التقنية المدمجة ، يتم تحويل مرسال الحمض الريبي النووي إلى دنا مكمل ، والذي يتم قياسه باستخدام qPCR. تقلل هذه التقنية من احتمالية الخطأ عند نقطة نهاية تفاعل البوليميراز المتسلسل, مما يزيد من فرص اكتشاف الجينات المرتبطة بالأمراض الجينية مثل السرطان . تستخدم المختبرات RT-qPCR لغرض قياس تنظيم الجينات بحساسية .

Medical and diagnostic applications

يمكن اختبار الآباء المحتملين لكونهم حاملين وراثيين، أوقد يخضع أطفالهم للفحص طالما كونهم مصابين عملياً بأحد الأمراض. يمكن الحصول على عينات الدنا لفحص ما بعد الولادة عن طريق ، ، أوحتى عن طريق تحليل خلايا الجنين النادرة المنتشرة في مجرى دم الأم. كما يعتبر تحليل تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) أساسياً للتحليل الوراثي السابق للانغراس، حيث يتم اختبار الخلايا الفردية للجنين النامي بحثاً عن طفرات.

  • قد يستخدم تحليل الپي سي آر أيضاً كجزء من اختبار الحساسية للتطابق النسيجي، الذي يعتبر أساسياً لزراعة الأعضاء. اعتباراً من 2008، كان هناك مقترحاً باستبدال الفحوصات التقليدية المعتمدة على الأجسام المضادة لفصيلة الدم بفحوصات تعتمد على تفاعل الپوليمريز المتسلسل (PCR).
  • تتضمن الكثير من أشكال السرطان تعديلات على الجينات السرطانية. باستخدام الاختبارات المستندة إلى تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) لدراسة هذه الطفرات ، يمكن في بعض الأحيان تخصيص أنظمة العلاج بشكل فردي للمريض. يسمح تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR)بالتشخيص المبكر للأمراض الخبيثة مثل ابيضاض الدم ولمفومة، والتي تعد حاليًا الأعلى تطورًا في أبحاث السرطان ويتم استخدامها بالعمل بشكل روتيني. يمكن إجراء فحوصات تفاعل الپوليمريز المتسلسل (PCR) مباشرة على عينات الحمض النووي الجيني للكشف عن الخلايا الخبيثة الخاصة بنقل الدم بحساسية أعلى بما لا يقل عن 10000 مرة من تلك الموجودة في الطرق الأخرى تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) مفيد للغاية في المجال الطبي لأنه يسمح بعزل وتضخيم مثبطات الورم. يمكن استعمال تفاعل الپوليمريز المتسلسل (PCR) الكمي ، على سبيل المثال ، لقياس وتحليل الخلايا المفردة ، بالإضافة إلى التعهد على تأكيدات وهجريبات الدنا (DNA) ومرسال الحمض النووي الريبي(mRNA) والبروتين.

Infectious disease applications

يسمح تفاعل البوليميريز المتسلسل (PCR) بالتشخيص السريع والدقيق للغاية للأمراض المعدية ، بما في ذلك الأمراض التي تسببها البكتيريا أوالفيروسات. يسمح تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) أيضًا بتحديد الكائنات الحية الدقيقة غير القابلة للزراعة أوالميكروبات بطيئة النمومثل المتفطرات وجراثيم لاهوائية أوالفيروسات من فحوصات زراعة الأنسجة والنماذج الحيوانية. أساس التطبيقات التشخيصية لتفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR)في فهم الأحياء الدقيقة هوالكشف عن العوامل المعدية والتمييز  بين السلالات الغير مسقمة من السلالات المسقمة بحكم جينات محددة.

أحدثت عملية الكشف عن الكائنات الحية المعدية وكشفها ثورة في تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) بالطرق التالية:

  • ڤيروس نقص المناعة البشرية (أومتلازمة نقص المناعة المكتسبة) ، هدف قاسي العثور عليه والقضاء عليه. اعتمدت الاختبارات المبكرة للعدوى على وجود أجسام مضادة للفيروس منتشر في مجرى الدم. ومع ذلك ، لا تظهر الأجسام المضادة حتى أسابيع عديدة بعد الإصابة ، والأجسام المضادة للأمهات تغطي علي  إصابة المولود بالعدوي ، ولا تؤثر العوامل العلاجية لمحاربة العدوى على الأجسام المضادة. تم تطوير اختبارات تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) التي يمكنها اكتشاف ما لا يقل عن جينوم فيروسي واحد بين الحمض النووي لأكثر من 50000 خلية مضيفة. يمكن الكشف عن العدوى في وقت مبكر ، ويمكن فحص الدم الخاص بالمتبرع مباشرة لوجود الفيروس ، ويمكن فحص الأطفال حديثي الولادة على الفور للعدوى ، ويمكن قياس آثار العلاجات المضادة للفيروسات .
  • يصعب أخذ عينات من بعض الكائنات الحية المسببة للسقم ، مثل السل ، من السقمى ويتباطأ نموها في المختبر. سمحت الاختبارات القائمة على تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) للكشف عن أعداد صغيرة من الكائنات الحية (سواء الحية أوالميتة) ، في عينات مناسبة. يمكن أيضًا استخدام التحليل الجيني المفصل للكشف عن مقاومة المضادات الحيوية ، مما يسمح بالعلاج الفوري والفعال. يمكن أيضًا تقييم آثار العلاج على الفور.
  • يمكن مراقبة انتشار كائن حي مسقم من خلال تجمعات الحيوانات الأليفة أوالبرية عن طريق اختبار تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR). في كثير من الحالات ، يمكن الكشف عن ظهور أنواع فرعية جديدة خبيثة ومراقبتها. يمكن أيضًا تحديد الأنواع الفرعية للكائن المسؤول عن الأوبئة المبكرة عن طريق تحليل تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR).
  • يمكن الكشف عن الحمض النووي الفيروسي بواسطة تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR). يجب حتى تكون البادئات المستخدمة خاصة بالتسلسلات المستهدفة في الحمض النووي (الدنا)للفيروس ، ويمكن استعمال تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) للتحليل التشخيصي أوتسلسل الحمض النووي للجينوم الفيروسي. تسمح الحساسية العالية لتفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) باكتشاف الفيروس بعد فترة وجيزة من الإصابة وحتى قبل ظهور السقم. قد يمنح هذا الكشف المبكر الأطباء مهلة زمنية كبيرة في العلاج. يمكن أيضًا قياس كمية الفيروس ("الحمل الفيروسي") في المريض من خلال تقنيات قياس الحمض النووي القائمة على تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) (انظر أدناه).
  • أمراض مثل الشاهوق (أوالسعال الديكي) تسببها بكتيريا بورديتيلة السعال الديكي. تتميز هذه البكتيريا بعدوى تنفسية حادة خطيرة تصيب الكثير من الحيوانات والبشر وتؤدي إلى وفاة الكثير من الأطفال الصغار. سم السعال الديكي هوبروتين خارجي يرتبط بمستقبلات الخلايا بعاملين ويتفاعل مع أنواع مختلفة من الخلايا مثل الخلايا اللمفاوية التائية التي تلعب دورًا في مناعة الخلايا. تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) هوأداة اختبار مهمة يمكنها اكتشاف التسلسلات الموجودة داخل جين سم السعال الديكي. هذا لأن تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) لديه حساسية عالية للسموم وقد أظهر وقت استجابة سريع. تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) فعال جدا لتشخيص السعال الديكي عند مقارنته بالزراعة.


تطبيقات الطب الشرعي

شهد تطوير بروتوكولات بصمات الأصابع الجينية (أوالدنا ) القائمة على PCR تطبيقًا واسعًا في الطب الشرعي :

  • في أكثر أشكالها تميزًا ، يمكن حتى تميز البصمات الوراثية بشكل فريد أي إنسان من جميع سكان العالم . يمكن عزل عينات دقيقة من الحمض النووي من مسرح الجريمة ، ومقارنتها مع المشتبه بهم ، أومن قاعدة بيانات الحمض النووي للأدلة السابقة أوالمدانين. غالبًا ما تُستخدم الإصدارات الأبسط من هذه الاختبارات لاستبعاد المشتبه بهم بسرعة أثناء التحقيق الجنائي. يمكن اختبار الأدلة المستمدة من الجرائم التي استمرت لعقود ، وتأكيد أوتبرئة الأشخاص المدانين أصلاً.
  • لقد كان تنميط الحمض النووي للطب الشرعي طريقة فعالة لتحديد أوتبرئة المشتبهين الجنائيين بسبب تحليل الأدلة المكتشفة في مسرح الجريمة. يحتوي الجينوم البشري على الكثير من المناطق المتكررة التي يمكن العثور عليها في تسلسل الجينات أوفي المناطق غير المشفرة من الجينوم. على وجه التحديد ، ما يصل إلى 40 ٪ من الحمض النووي البشري متكرر. هناك فئتان مميزتان لهذه المناطق المتكررة غير المشفرة في الجينوم. تسمى الفئة الأولى التكرارات الترادفية ذات الرقم المتغير (VNTR) ، والتي يتراوح طولها بين 10-100 زوج أساسي وتسمى الفئة الثانية التكرارات الترادفية القصيرة (STR) وتتكون من أقسام زوجية أساسية متكررة 2-10. يستخدم PCR لتضخيم الكثير من VNTRs وSTRs المعروفة باستخدام المشرع الذي يحيط بكل منطقة متكررة. ستشير أحجام الاجزاء التي تم الحصول عليها من أي فرد لكل من تقارير المعاملات المشبوهة إلى الأليلات الموجودة. من خلال تحليل الكثير من تقارير المعاملات المشبوهة للفرد ، سيتم العثور على مجموعة من الأليلات لكل إنسان أنه من المحتمل إحصائيًا حتىقد يكون فريدًا. حدد الباحثون التسلسل الكامل للجينوم البشري. يمكن الوصول إلى هذا التسلسل بسهولة من خلال مسقط NCBI ويستخدم في الكثير من التطبيقات الواقعية. على سبيل المثال ، قام مخط التحقيقات الفدرالي بتجميع مجموعة من مواقع علامات الحمض النووي المستخدمة في تحديد الهوية ، وتسمى هذه قاعدة بيانات الحمض النووي لنظام فهرس الحمض النووي المشهجر (CODIS) يمكّن استخدام قاعدة البيانات هذه من استخدام التحليل الإحصائي لتحديد احتمال تطابق عينة من الحمض النووي. PCR هوأداة تحليلية قوية ومهمة للغاية لاستخدامها في تنميط الطب الشرعي للحمض النووي لأن الباحثين يحتاجون فقط إلى كمية صغيرة جدًا من الحمض النووي المستهدف لاستخدامها في التحليل. على سبيل المثال ، يحتوي شعر بشري واحد مع بصيلات شعر ملحقة على ما يكفي من الحمض النووي لإجراء التحليل. وبالمثل ، يمكن حتى يوفر عدد قليل من الحيوانات المنوية وعينات الجلد من تحت الأظافر أوكمية صغيرة من الدم ما يكفي من الحمض النووي للتحليل القاطع.
  • أقل الاشكال تمييزًا بصمة الحمض النووي يمكن حتى تساعد في اختبار الأبوة بالدنا ، حيث يتطابق الفرد مع أقاربهم. يمكن اختبار الحمض النووي من بقايا بشرية مجهولة الهوية ومقارنتها بالآباء أوالأشقاء أوالأطفال المحتملين. يمكن استعمال اختبار مماثل لتأكيد الوالدين البيولوجيين لطفل تم تبنيه (أواختطافه). يمكن أيضًا تأكيد الأب البيولوجي العملي لحديثي الولادة (أواستبعاده).
  • لقد ثبت حتى تصميم PCR AMGX / AMGY ليس فقط تسهيل تضخيم تسلسلات الحمض النووي من كمية ضئيلة جدًا من الجينوم. ومع ذلك ، يمكن استخدامه أيضًا لتحديد الجنس في الوقت الحقيقي من عينات عظام الطب الشرعي. وهذا يوفر لنا طريقة قوية وفعالة لتحديد جنس العينات القديمة فقط ولكن أيضًا المشتبه بهم الحاليين في الجرائم.


أحدثت عملية الكشف عن الكائنات الحية المعدية وكشفها ثورة في تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) بالطرق التالية:

  • ڤيروس نقص المناعة البشرية (أومتلازمة نقص المناعة المكتسبة) ، هدف قاسي العثور عليه والقضاء عليه. اعتمدت الاختبارات المبكرة للعدوى على وجود أجسام مضادة للفيروس منتشر في مجرى الدم. ومع ذلك ، لا تظهر الأجسام المضادة حتى أسابيع عديدة بعد الإصابة ، والأجسام المضادة للأمهات تغطي علي  إصابة المولود بالعدوي ، ولا تؤثر العوامل العلاجية لمحاربة العدوى على الأجسام المضادة. تم تطوير اختبارات تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) التي يمكنها اكتشاف ما لا يقل عن جينوم فيروسي واحد بين الحمض النووي لأكثر من 50000 خلية مضيفة. يمكن الكشف عن العدوى في وقت مبكر ، ويمكن فحص الدم الخاص بالمتبرع مباشرة لوجود الفيروس ، ويمكن فحص الأطفال حديثي الولادة على الفور للعدوى ، ويمكن قياس آثار العلاجات المضادة للفيروسات .
  • يصعب أخذ عينات من بعض الكائنات الحية المسببة للسقم ، مثل السل ، من السقمى ويتباطأ نموها في المختبر. سمحت الاختبارات القائمة على تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) للكشف عن أعداد صغيرة من الكائنات الحية (سواء الحية أوالميتة) ، في عينات مناسبة. يمكن أيضًا استخدام التحليل الجيني المفصل للكشف عن مقاومة المضادات الحيوية ، مما يسمح بالعلاج الفوري والفعال. يمكن أيضًا تقييم آثار العلاج على الفور.
  • يمكن مراقبة انتشار كائن حي مسقم من خلال تجمعات الحيوانات الأليفة أوالبرية عن طريق اختبار تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR). في كثير من الحالات ، يمكن الكشف عن ظهور أنواع فرعية جديدة خبيثة ومراقبتها. يمكن أيضًا تحديد الأنواع الفرعية للكائن المسؤول عن الأوبئة المبكرة عن طريق تحليل تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR).
  • يمكن الكشف عن الحمض النووي الفيروسي بواسطة تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR). يجب حتى تكون البادئات المستخدمة خاصة بالتسلسلات المستهدفة في الحمض النووي (الدنا)للفيروس ، ويمكن استعمال تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) للتحليل التشخيصي أوتسلسل الحمض النووي للجينوم الفيروسي. تسمح الحساسية العالية لتفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) باكتشاف الفيروس بعد فترة وجيزة من الإصابة وحتى قبل ظهور السقم. قد يمنح هذا الكشف المبكر الأطباء مهلة زمنية كبيرة في العلاج. يمكن أيضًا قياس كمية الفيروس ("الحمل الفيروسي") في المريض من خلال تقنيات قياس الحمض النووي القائمة على تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) (انظر أدناه).
  • أمراض مثل الشاهوق (أوالسعال الديكي) تسببها بكتيريا بورديتيلة السعال الديكي. تتميز هذه البكتيريا بعدوى تنفسية حادة خطيرة تصيب الكثير من الحيوانات والبشر وتؤدي إلى وفاة الكثير من الأطفال الصغار. سم السعال الديكي هوبروتين خارجي يرتبط بمستقبلات الخلايا بعاملين ويتفاعل مع أنواع مختلفة من الخلايا مثل الخلايا اللمفاوية التائية التي تلعب دورًا في مناعة الخلايا. تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) هوأداة اختبار مهمة يمكنها اكتشاف التسلسلات الموجودة داخل جين سم السعال الديكي. هذا لأن تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) لديه حساسية عالية للسموم وقد أظهر وقت استجابة سريع. تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) فعال جدا لتشخيص السعال الديكي عند مقارنته بالزراعة.

الاستخدامات البحثية

تم تطبيق PCR على الكثير من مجالات البحث في فهم الوراثة الجزيئي:

  • يسمح تفاعل البلمرة التسلسلي (PCR) بالإنتاج السريع للبتر القصيرة من الدنا ، حتى عندما لا يعهد اكثر من تسلسل مشرعيين . هذه القدرة من PCR تقوي الكثير من الطرق، مثل توليد مسبارات تهجين للطختي نورثرن وساوثرن. يزود PCR هذه التقنيات بكميات كبيرة من الحمض النووي النقي ، أحيانًا كشريط واحد ، مما يتيح التحليل حتى من كميات صغيرة جدًا من مادة البدء.
    • يساعد تفاعل البوليمراز التسلسلي أيضًا وظيفة تسلسل الدنا. يمكن بسهولة إنتاج الأجزاء المعروفة من الحمض النووي من مريض يعاني من طفرة سقمية وراثية. يمكن للتعديلات في تقنية التضخيم حتى تستخرج شرائح من جينوم غير معروف تمامًا ، أويمكن حتى تولد فقط سلسلة واحدة من منطقة المرغوب نسخها.
  • يحتوي PCR على الكثير من التطبيقات لعملية استنساخ الحمض النووي الأكثر تقليدية. يمكنه استخراج أجزاء لإدخالها في ناقل من جينوم أكبر ، والتي قد تكون متاحة فقط بكميات صغيرة. باستخدام مجموعة واحدة من "المشرعات الناقلة" ، يمكنها أيضًا تحليل أواستخراج الأجزاء التي تم إدخالها بالعمل في الناقلات. يمكن حتى تؤدي بعض التعديلات على بروتوكول PCR إلى حدوث طفرات (عامة أوموجهة نحوالمسقط) للجزء المدرج.
    • مواقع واصمات التسلسل عمليةٌ يُستخدَم فيها تفاعل البوليمراز المتسلسل بمثابة مؤشر لوجود بترة محددة من الجينوم في نسيلة معينة. عثر مشروع الجينوم البشري هذا التطبيق شديد الأهمية لرسم خرائط النسائل الكونية للسلاسل، ولتنسيق النتائج من المختبرات المختلف
  • An exciting application of PCR is the phylogenic analysis of DNA from ancient sources, such as that found in the recovered bones of Neanderthals, from frozen tissues of mammoths, or from the brain of Egyptian mummies. Have been amplified and sequenced. In some cases the highly degraded DNA from these sources might be reassembled during the early stages of amplification.
  • A common application of PCR is the study of patterns of gene expression. Tissues (or even individual cells) can be analyzed at different stages to see which genes have become active, or which have been switched off. This application can also use quantitative PCR to quantitate the actual levels of expression
  • The ability of PCR to simultaneously amplify several loci from individual sperm has greatly enhanced the more traditional task of genetic mapping by studying chromosomal crossovers after meiosis. Rare crossover events between very close loci have been directly observed by analyzing thousands of individual sperms. Similarly, unusual deletions, insertions, translocations, or inversions can be analyzed, all without having to wait (or pay) for the long and laborious processes of fertilization, embryogenesis, etc.
  • Site-directed mutagenesis: PCR can be used to create mutant genes with mutations chosen by scientists at will. These mutations can be chosen in order to understand how proteins accomplish their functions, and to change or improve protein function.


Advantages

PCR has a number of advantages. It is fairly simple to understand and to use, and produces results rapidly. The technique is highly sensitive with the potential to produce millions to billions of copies of a specific product for sequencing, cloning, and analysis. qRT-PCR shares the same advantages as the PCR, with an added advantage of quantification of the synthesized product. Therefore, it has its uses to analyze alterations of gene expression levels in tumors, microbes, or other disease states.

PCR is a very powerful and practical research tool. The sequencing of unknown etiologies of many diseases are being figured out by the PCR. The technique can help identify the sequence of previously unknown viruses related to those already known and thus give us a better understanding of the disease itself. If the procedure can be further simplified and sensitive non radiometric detection systems can be developed, the PCR will assume a prominent place in the clinical laboratory for years to come.


Limitations

One major limitation of PCR is that prior information about the target sequence is necessary in order to generate the primers that will allow its selective amplification. This means that, typically, PCR users must know the precise sequence(s) upstream of the target region on each of the two single-stranded templates in order to ensure that the DNA polymerase properly binds to the primer-template hybrids and subsequently generates the entire target region during DNA synthesis.

Like all enzymes, DNA polymerases are also prone to error, which in turn causes mutations in the PCR fragments that are generated.

Another limitation of PCR is that even the smallest amount of contaminating DNA can be amplified, resulting in misleading or ambiguous results. To minimize the chance of contamination, investigators should reserve separate rooms for reagent preparation, the PCR, and analysis of product. Reagents should be dispensed into single-use aliquots. Pipettors with disposable plungers and extra-long pipette tips should be routinely used.


Variations

  • Allele-specific PCR: a diagnostic or cloning technique based on single-nucleotide variations (SNVs not to be confused with SNPs) (single-base differences in a patient). It requires prior knowledge of a DNA sequence, including differences between alleles, and uses primers whose 3' ends encompass the SNV (base pair buffer around SNV usually incorporated). PCR amplification under stringent conditions is much less efficient in the presence of a mismatch between template and primer, so successful amplification with an SNP-specific primer signals presence of the specific SNP in a sequence. See SNP genotyping for more information.
  • Assembly PCR or Polymerase Cycling Assembly (PCA): artificial synthesis of long DNA sequences by performing PCR on a pool of long oligonucleotides with short overlapping segments. The oligonucleotides alternate between sense and antisense directions, and the overlapping segments determine the order of the PCR fragments, thereby selectively producing the final long DNA product.
  • Asymmetric PCR: preferentially amplifies one DNA strand in a double-stranded DNA template. It is used in sequencing and hybridization probing where amplification of only one of the two complementary strands is required. PCR is carried out as usual, but with a great excess of the primer for the strand targeted for amplification. Because of the slow (arithmetic) amplification later in the reaction after the limiting primer has been used up, extra cycles of PCR are required. A recent modification on this process, known as Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR), uses a limiting primer with a higher melting temperature () than the excess primer to maintain reaction efficiency as the limiting primer concentration decreases mid-reaction.
  • Convective PCR: a pseudo-isothermal way of performing PCR. Instead of repeatedly heating and cooling the PCR mixture, the solution is subjected to a thermal gradient. The resulting thermal instability driven convective flow automatically shuffles the PCR reagents from the hot and cold regions repeatedly enabling PCR. Parameters such as thermal boundary conditions and geometry of the PCR enclosure can be optimized to yield robust and rapid PCR by harnessing the emergence of chaotic flow fields. Such convective flow PCR setup significantly reduces device power requirement and operation time.
  • Dial-out PCR: a highly parallel method for retrieving accurate DNA molecules for gene synthesis. A complex library of DNA molecules is modified with unique flanking tags before massively parallel sequencing. Tag-directed primers then enable the retrieval of molecules with desired sequences by PCR.
  • Digital PCR (dPCR): used to measure the quantity of a target DNA sequence in a DNA sample. The DNA sample is highly diluted so that after running many PCRs in parallel, some of them do not receive a single molecule of the target DNA. The target DNA concentration is calculated using the proportion of negative outcomes. Hence the name 'digital PCR'.
  • Helicase-dependent amplification: similar to traditional PCR, but uses a constant temperature rather than cycling through denaturation and annealing/extension cycles. DNA helicase, an enzyme that unwinds DNA, is used in place of thermal denaturation.
  • Hot start PCR: a technique that reduces non-specific amplification during the initial set up stages of the PCR. It may be performed manually by heating the reaction components to the denaturation temperature (e.g., 95 °C) before adding the polymerase. Specialized enzyme systems have been developed that inhibit the polymerase's activity at ambient temperature, either by the binding of an antibody or by the presence of covalently bound inhibitors that dissociate only after a high-temperature activation step. Hot-start/cold-finish PCR is achieved with new hybrid polymerases that are inactive at ambient temperature and are instantly activated at elongation temperature.
  • In silico PCR (digital PCR, virtual PCR, electronic PCR, e-PCR) refers to computational tools used to calculate theoretical polymerase chain reaction results using a given set of primers (probes) to amplify DNA sequences from a sequenced genome or transcriptome. In silico PCR was proposed as an educational tool for molecular biology.
  • Intersequence-specific PCR (ISSR): a PCR method for DNA fingerprinting that amplifies regions between simple sequence repeats to produce a unique fingerprint of amplified fragment lengths.
  • Inverse PCR: is commonly used to identify the flanking sequences around genomic inserts. It involves a series of DNA digestions and self ligation, resulting in known sequences at either end of the unknown sequence.
  • Ligation-mediated PCR: uses small DNA linkers ligated to the DNA of interest and multiple primers annealing to the DNA linkers; it has been used for DNA sequencing, genome walking, and DNA footprinting.
  • Methylation-specific PCR (MSP): developed by Stephen Baylin and James G. Herman at the Johns Hopkins School of Medicine, and is used to detect methylation of CpG islands in genomic DNA. DNA is first treated with sodium bisulfite, which converts unmethylated cytosine bases to uracil, which is recognized by PCR primers as thymine. Two PCRs are then carried out on the modified DNA, using primer sets identical except at any CpG islands within the primer sequences. At these points, one primer set recognizes DNA with cytosines to amplify methylated DNA, and one set recognizes DNA with uracil or thymine to amplify unmethylated DNA. MSP using qPCR can also be performed to obtain quantitative rather than qualitative information about methylation.
  • Miniprimer PCR: uses a thermostable polymerase (S-Tbr) that can extend from short primers ("smalligos") as short asتسعة orعشرة nucleotides. This method permits PCR targeting to smaller primer binding regions, and is used to amplify conserved DNA sequences, such as the 16S (or eukaryotic 18S) rRNA gene.
  • Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA): permits amplifying multiple targets with a single primer pair, thus avoiding the resolution limitations of multiplex PCR (see below).
  • Multiplex-PCR: consists of multiple primer sets within a single PCR mixture to produce amplicons of varying sizes that are specific to different DNA sequences. By targeting multiple genes at once, additional information may be gained from a single test-run that otherwise would require several times the reagents and more time to perform. Annealing temperatures for each of the primer sets must be optimized to work correctly within a single reaction, and amplicon sizes. That is, their base pair length should be different enough to form distinct bands when visualized by gel electrophoresis.
  • Nanoparticle-Assisted PCR (nanoPCR): some nanoparticles (NPs) can enhance the efficiency of PCR (thus being called nanoPCR), and some can even outperform the original PCR enhancers. It was reported that quantum dots (QDs) can improve PCR specificity and efficiency. Single-walled carbon nanotubes (SWCNTs) and multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) are efficient in enhancing the amplification of long PCR. Carbon nanopowder (CNP) can improve the efficiency of repeated PCR and long PCR, while zinc oxide, titanium dioxide and Ag NPs were found to increase the PCR yield. Previous data indicated that non-metallic NPs retained acceptable amplification fidelity. Given that many NPs are capable of enhancing PCR efficiency, it is clear that there is likely to be great potential for nanoPCR technology improvements and product development.
  • Nested PCR: increases the specificity of DNA amplification, by reducing background due to non-specific amplification of DNA. Two sets of primers are used in two successive PCRs. In the first reaction, one pair of primers is used to generate DNA products, which besides the intended target, may still consist of non-specifically amplified DNA fragments. The product(s) are then used in a second PCR with a set of primers whose binding sites are completely or partially different from and located 3' of each of the primers used in the first reaction. Nested PCR is often more successful in specifically amplifying long DNA fragments than conventional PCR, but it requires more detailed knowledge of the target sequences.
  • Overlap-extension PCR or Splicing by overlap extension (SOEing) : a genetic engineering technique that is used to splice together two or more DNA fragments that contain complementary sequences. It is used to join DNA pieces containing genes, regulatory sequences, or mutations; the technique enables creation of specific and long DNA constructs. It can also introduce deletions, insertions or point mutations into a DNA sequence.
  • PAN-AC: uses isothermal conditions for amplification, and may be used in living cells.
  • quantitative PCR (qPCR): used to measure the quantity of a target sequence (commonly in real-time). It quantitatively measures starting amounts of DNA, cDNA, or RNA. quantitative PCR is commonly used to determine whether a DNA sequence is present in a sample and the number of its copies in the sample. Quantitative PCR has a very high degree of precision. Quantitative PCR methods use fluorescent dyes, such as Sybr Green, EvaGreen or fluorophore-containing DNA probes, such as TaqMan, to measure the amount of amplified product in real time. It is also sometimes abbreviated to RT-PCR (real-time PCR) but this abbreviation should be used only for reverse transcription PCR. qPCR is the appropriate contractions for quantitative PCR (real-time PCR).
  • Reverse Transcription PCR (RT-PCR): for amplifying DNA from RNA. Reverse transcriptase reverse transcribes RNA into cDNA, which is then amplified by PCR. RT-PCR is widely used in expression profiling, to determine the expression of a gene or to identify the sequence of an RNA transcript, including transcription start and termination sites. If the genomic DNA sequence of a gene is known, RT-PCR can be used to map the location of exons and introns in the gene. The 5' end of a gene (corresponding to the transcription start site) is typically identified by RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends).
  • RNase H-dependent PCR (rhPCR): a modification of PCR that utilizes primers with a 3’ extension block that can be removed by a thermostable RNase HII enzyme. This system reduces primer-dimers and allows for multiplexed reactions to be performed with higher numbers of primers.
  • Single Specific Primer-PCR (SSP-PCR): allows the amplification of double-stranded DNA even when the sequence information is available at one end only. This method permits amplification of genes for which only a partial sequence information is available, and allows unidirectional genome walking from known into unknown regions of the chromosome.
  • Solid Phase PCR: encompasses multiple meanings, including Polony Amplification (where PCR colonies are derived in a gel matrix, for example), Bridge PCR (primers are covalently linked to a solid-support surface), conventional Solid Phase PCR (where Asymmetric PCR is applied in the presence of solid support bearing primer with sequence matching one of the aqueous primers) and Enhanced Solid Phase PCR (where conventional Solid Phase PCR can be improved by employing high Tm and nested solid support primer with optional application of a thermal 'step' to favour solid support priming).
  • Suicide PCR: typically used in paleogenetics or other studies where avoiding false positives and ensuring the specificity of the amplified fragment is the highest priority. It was originally described in a study to verify the presence of the microbe Yersinia pestis in dental samples obtained from 14th Century graves of people supposedly killed by plague during the medieval Black Death epidemic. The method prescribes the use of any primer combination only once in a PCR (hence the term "suicide"), which should never have been used in any positive control PCR reaction, and the primers should always target a genomic region never amplified before in the lab using this or any other set of primers. This ensures that no contaminating DNA from previous PCR reactions is present in the lab, which could otherwise generate false positives.
  • Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR): for isolation of an unknown sequence flanking a known sequence. Within the known sequence, TAIL-PCR uses a nested pair of primers with differing annealing temperatures; a degenerate primer is used to amplify in the other direction from the unknown sequence.
  • Touchdown PCR (Step-down PCR): a variant of PCR that aims to reduce nonspecific background by gradually lowering the annealing temperature as PCR cycling progresses. The annealing temperature at the initial cycles is usually a few degrees (3–5 °C) above the Tm of the primers used, while at the later cycles, it is a few degrees (3–5 °C) below the primer Tm. The higher temperatures give greater specificity for primer binding, and the lower temperatures permit more efficient amplification from the specific products formed during the initial cycles.
  • Universal Fast Walking: for genome walking and genetic fingerprinting using a more specific 'two-sided' PCR than conventional 'one-sided' approaches (using only one gene-specific primer and one general primer—which can lead to artefactual 'noise') by virtue of a mechanism involving lariat structure formation. Streamlined derivatives of UFW are LaNe RAGE (lariat-dependent nested PCR for rapid amplification of genomic DNA ends), 5'RACE LaNe and 3'RACE LaNe.


History

Diagrammatic representation of an example primer pair. The use of primers in an in vitro assay to allow DNA synthesis was a major innovation that allowed the development of PCR.


The heat-resistant enzymes that are a key component in polymerase chain reaction were discovered in the 1960s as a product of a microbial life form that lived in the superheated waters of Yellowstone’s Mushroom Spring.

A 1971 paper in the Journal of Molecular Biology by Kjell Kleppe (no) and co-workers in the laboratory of H. Gobind Khorana first described a method of using an enzymatic assay to replicate a short DNA template with primers in vitro. However, this early manifestation of the basic PCR principle did not receive much attention at the time and the invention of the polymerase chain reaction in 1983 is generally credited to Kary Mullis.

"Baby Blue", a 1986 prototype machine for doing PCR

When Mullis developed the PCR in 1983, he was working in Emeryville, California for Cetus Corporation, one of the first biotechnology companies, where he was responsible for synthesizing short chains of DNA. Mullis has written that he conceived the idea for PCR while cruising along the Pacific Coast Highway one night in his car. He was playing in his mind with a new way of analyzing changes (mutations) in DNA when he realized that he had instead invented a method of amplifying any DNA region through repeated cycles of duplication driven by DNA polymerase. In Scientific American, Mullis summarized the procedure: "Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube, a few simple reagents, and a source of heat." DNA fingerprinting was first used for paternity testing in 1988.

Mullis was awarded the Nobel Prize in Chemistry in 1993 for his invention, seven years after he and his colleagues at Cetus first put his proposal to practice. Mullis's 1985 paper with R. K. Saiki and H. A. Erlich, “Enzymatic Amplification of β-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia”—the polymerase chain reaction invention (PCR) – was honored by a Citation for Chemical Breakthrough Award from the Division of History of Chemistry of the American Chemical Society in 2017.

At the core of the PCR method is the use of a suitable DNA polymerase able to withstand the high temperatures of >90 °م (194 °ف) required for separation of the two DNA strands in the DNA double helix after each replication cycle. The DNA polymerases initially employed for in vitro experiments presaging PCR were unable to withstand these high temperatures. So the early procedures for DNA replication were very inefficient and time-consuming, and required large amounts of DNA polymerase and continuous handling throughout the process.

The discovery in 1976 of Taq polymerase—a DNA polymerase purified from the thermophilic bacterium, Thermus aquaticus, which naturally lives in hot (50 to 80 °م (122 to 176 °ف)) environments such as hot springs—paved the way for dramatic improvements of the PCR method. The DNA polymerase isolated from T. aquaticus is stable at high temperatures remaining active even after DNA denaturation, thus obviating the need to add new DNA polymerase after each cycle. This allowed an automated thermocycler-based process for DNA amplification.

Patent disputes

تقنية تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) حصلت على براءة اختراعها شركة ستس Cetus Corporation، حيث كان يعمل مليس حين اخترع التقنية في 1983. كما تمت تغطية إنزيم تاك الپوليمريز بواسطة براءات الاختراع. كانت هناك الكثير من النادىوى القضائية البارزة المتعلقة بهذه التقنية, بما فيها القضية الفاشلة التي أقامتها دوپونت. اشترت شركة المستحضرات الصيدلية هوفمان-لا روش حقوق براءات الاختراع في 1992 وتحتفظ حالياً بتلك البراءات التي مازالت سارية.

لا تزال معركة براءات الاختراع ذات الصلة حول إنزيم تاك الپوليمريز مستمرة في الكثير من السلطات القضائية حول العالم بين روش وبروميجا. لقد امتدت الجدالات القانونية إلى ما بعد صلاحية براءات اختراع تفاعل الپوليمريز المتسلسل(PCR) وتاك الپوليمريز الأصلية ، والتي انتهت صلاحيتها في 28 مارس, 2005

انظر أيضاً

  • DNA spiking
  • Loop-mediated isothermal amplification
  • Selector-technique

المصادر

  1. ^ Saiki, R.; Scharf, S.; Faloona, F.; Mullis, K.; Horn, G.; Erlich, H.; Arnheim, N. (1985). "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia". Science. 230 (4732): 1350–1354. Bibcode:1985Sci...230.1350S. doi:10.1126/science.2999980. PMID 2999980.
  2. ^ Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S.; Scharf, S.; Higuchi, R.; Horn, G.; Mullis, K.; Erlich, H. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase". Science. 239 (4839): 487–491. Bibcode:1988Sci...239..487S. doi:10.1126/science.239.4839.487. PMID 2448875.
  3. ^ "Determining Annealing Temperatures for Polymerase Chain Reaction". The American Biology Teacher. 74 (4): 256–260. 2012. doi:10.1525/abt.2012.74.4.9.
  4. ^ Ninfa, Alexander; Ballou, David; Benore, Marilee (2009). Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology. United States: Wiley. pp. 408–410. ISBN .
  5. ^ Cheng, S.; Fockler, C.; Barnes, W. M.; Higuchi, R. (1994). "Effective Amplification of Long Targets from Cloned Inserts and Human Genomic DNA". Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (12): 5695–5699. Bibcode:1994PNAS...91.5695C. doi:10.1073/pnas.91.12.5695. PMC 44063. PMID 8202550.
  6. ^ Carr AC, Moore SD (2012). Lucia A (ed.). "Robust quantification of polymerase chain reactions using global fitting". PLOS One. 7 (5): e37640. Bibcode:2012PLoSO...737640C. doi:10.1371/journal.pone.0037640. PMC 3365123. PMID 22701526.
  7. ^ Joseph Sambrook & David W. Russel (2001). (3rd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN . Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction
  8. ^ "Polymerase Chain Reaction (PCR)". National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine.
  9. ^ "PCR". Genetic Science Learning Center, University of Utah.
  10. ^ Pavlov, A. R.; Pavlova, N. V.; Kozyavkin, S. A.; Slesarev, A. I. (2004). "Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications☆". Trends in Biotechnology. 22 (5): 253–260. doi:10.1016/j.tibtech.2004.02.011. PMID 15109812.
  11. ^ Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE (1990). "Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro". Nucleic Acids Res. 18 (21): 6409–6412. doi:10.1093/nar/18.21.6409. PMC 332522. PMID 2243783.
  12. ^ Sharkey, D. J.; Scalice, E. R.; Christy, K. G.; Atwood, S. M.; Daiss, J. L. (1994). "Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the Polymerase Chain Reaction". Bio/Technology. 12 (5): 506–509. doi:10.1038/nbt0594-506. PMID 7764710.
  13. ^ Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus". J. Bacteriol. 127 (3): 1550–1557. doi:10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976. PMC 232952. PMID 8432.
  14. ^ Lawyer, F.; Stoffel, S.; Saiki, R.; Chang, S.; Landre, P.; Abramson, R.; Gelfand, D. (1993). "High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity". PCR Methods and Applications. 2 (4): 275–287. doi:10.1101/gr.2.4.275. PMID 8324500.
  15. ^ Schochetman, Gerald; Ou, Chin-Yih; Jones, Wanda K. (1988). "Polymerase Chain Reaction". The Journal of Infectious Diseases. 158 (6): 1154–1157. doi:10.1093/infdis/158.6.1154. JSTOR 30137034. PMID 2461996.
  16. ^ Borman, Jon; Schuster, David; Li, Wu-bo; Jessee, Joel; Rashtchian, Ayoub (2000). "PCR from problematic templates" (PDF). Focus. 22 (1): 10.
  17. ^ Bogetto, Prachi and Waidne, Lisa (2000). "Helpful tips for PCR" (PDF). Focus. 22 (1): 12.CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  18. ^ Sarkar, G.; Kapelner, S.; Sommer, S. (1990). "Formamide can dramatically improve the specificity of PCR". Nucleic Acids Research. 18 (24): 7465. doi:10.1093/nar/18.24.7465. PMC 332902. PMID 2259646.
  19. ^ "Electronic PCR". NCBI – National Center for Biotechnology Information. Retrieved 13 March 2012.
  20. ^ Pavlov AR, Pavlova NV, Kozyavkin SA, Slesarev AI (2006). "Thermostable DNA Polymerases for a Wide Spectrum of Applications: Comparison of a Robust Hybrid TopoTaq to other enzymes". In Kieleczawa J (ed.). DNA Sequencing II: Optimizing Preparation and Cleanup. Jones and Bartlett. pp. 241–257. ISBN .
  21. ^ Pombert JF, Sistek V, Boissinot M, Frenette M (2009). "Evolutionary relationships among salivarius streptococci as inferred from multilocus phylogenies based on 16S rRNA-encoding, recA, secA, and secY gene sequences". BMC Microbiol. 9: 232. doi:10.1186/1471-2180-9-232. PMC 2777182. PMID 19878555.
  22. ^ "Chemical Synthesis, Sequencing, and Amplification of DNA (class notes on MBB/BIO 343)". Arizona State University. Archived from the original onتسعة October 1997. Retrieved 29 October 2007.
  23. ^ Bustin, S. A.; Benes, V.; Garson, J. A.; Hellemans, J.; Huggett, J.; Kubista, M.; Mueller, R.; Nolan, T.; Pfaffl, M. W.; Shipley, G. L.; Vandesompele, J.; Wittwer, C. T. (2009). "The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments" (PDF). Clinical Chemistry. 55 (4): 611–622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797. PMID 19246619.
  24. ^ Garibyan, Avashia (March 2013). "Polymerase Chain Reaction". Journal of Investigative Dermatology. 133 (3): 1–4. doi:10.1038/jid.2013.1. PMC 4102308. PMID 23399825.
  25. ^ Quill, E. (2008). "Medicine. Blood-matching goes genetic". Science. 319 (5869): 1478–9. doi:10.1126/science.319.5869.1478. PMID 18339916.
  26. ^ Tomar, Rukam (2010). Molecular Markers and Plant Biotechnology. Pitman Pura, New Delhi: New India Publishing Agency. p. 188. ISBN .
  27. ^ Cai, H; Caswell JL; Prescott JF (March 2014). "Nonculture Molecular Techniques for Diagnosis of Bacterial Disease in Animals: A Diagnostic Laboratory Perspective". Veterinary Pathology. 51 (2): 341–350. doi:10.1177/0300985813511132. PMID 24569613.
  28. ^ Salis AD (2009). "Applications in Clinical Microbiology". Real-Time PCR: Current Technology and Applications. Caister Academic Press. ISBN .
  29. ^ Kwok, S.; Mack, D. H.; Mullis, K. B.; Poiesz, B.; Ehrlich, G.; Blair, D.; Friedman-Kien, A.; Sninsky, J. J. (1987). "Identification of human immunodeficiency virus sequences by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection". Journal of Virology. 61 (5): 1690–4. doi:10.1128/jvi.61.5.1690-1694.1987. PMC 254157. PMID 2437321.
  30. ^ Cai, H; Caswell JL; Prescott JF (March 2014). "Nonculture Molecular Techniques for Diagnosis of Bacterial Disease in Animals: A Diagnostic Laboratory Perspective". Veterinary Pathology. 51 (2): 341–350. doi:10.1177/0300985813511132. PMID 24569613.
  31. ^ Finger, Horst; von Koenig, Carl Heinz Wirsing (1996). Baron, Samuel (ed.). (4th ed.). Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston. ISBN . PMID 21413270.
  32. ^ Yeh, Sylvia H.; Mink, ChrisAnna M. (2012). "Bordetella pertussis and Pertussis (Whooping Cough)". Netter's Infectious Diseases. Netter's Infectious Diseases. pp. 11–14. doi:10.1016/B978-1-4377-0126-5.00003-3. ISBN .
  33. ^ Alonso, A (2004-01-28). "Real-time PCR designs to estimate nuclear and mitochondrial DNA copy number in forensic and ancient DNA studies". Forensic Science International. 139 (2–3): 141–149. doi:10.1016/j.forsciint.2003.10.008. PMID 15040907.
  34. ^ Kwok, S.; Mack, D. H.; Mullis, K. B.; Poiesz, B.; Ehrlich, G.; Blair, D.; Friedman-Kien, A.; Sninsky, J. J. (1987). "Identification of human immunodeficiency virus sequences by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection". Journal of Virology. 61 (5): 1690–4. doi:10.1128/jvi.61.5.1690-1694.1987. PMC 254157. PMID 2437321.
  35. ^ Cai, H; Caswell JL; Prescott JF (March 2014). "Nonculture Molecular Techniques for Diagnosis of Bacterial Disease in Animals: A Diagnostic Laboratory Perspective". Veterinary Pathology. 51 (2): 341–350. doi:10.1177/0300985813511132. PMID 24569613.
  36. ^ Finger, Horst; von Koenig, Carl Heinz Wirsing (1996). Baron, Samuel (ed.). (4th ed.). Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston. ISBN . PMID 21413270.
  37. ^ Yeh, Sylvia H.; Mink, ChrisAnna M. (2012). "Bordetella pertussis and Pertussis (Whooping Cough)". Netter's Infectious Diseases. Netter's Infectious Diseases. pp. 11–14. doi:10.1016/B978-1-4377-0126-5.00003-3. ISBN .
  38. ^ Boehnke, M.; Arnheim, N.; Li, H.; Collins, F. S. (1989). "Fine-structure genetic mapping of human chromosomes using the polymerase chain reaction on single sperm: Experimental design considerations". American Journal of Human Genetics. 45 (1): 21–32. PMC 1683385. PMID 2568090.
  39. ^ Garibyan, Lilit; Avashia, Nidhi (2013-03-01). "Polymerase Chain Reaction". Journal of Investigative Dermatology. 133 (3): 1–4. doi:10.1038/jid.2013.1. PMC 4102308. PMID 23399825.
  40. ^ Garibyan L, Avashia N (2013). "Polymerase Chain Reaction". Journal of Investigative Dermatology. 133 (3): 1–4. doi:10.1038/jid.2013.1. PMC 4102308. PMID 23399825.
  41. ^ Zhou, Y H; Zhang, X P; Ebright, R H (1991-11-11). "Random mutagenesis of gene-sized DNA molecules by use of PCR with Taq DNA polymerase". Nucleic Acids Research. 19 (21): 6052. doi:10.1093/nar/19.21.6052. PMC 329070. PMID 1658751.
  42. ^ Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith JC, Markham AF (1989). "Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS)". Nucleic Acids Research. 17 (7): 2503–2516. doi:10.1093/nar/17.7.2503. PMC 317639. PMID 2785681.
  43. ^ Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, Heyneker HL (1995). "Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides". Gene. 164 (1): 49–53. doi:10.1016/0378-1119(95)00511-4. PMID 7590320.
  44. ^ Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA (1988). "DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA". Proc Natl Acad Sci USA. 85 (24): 9436–9440. Bibcode:1988PNAS...85.9436I. doi:10.1073/pnas.85.24.9436. PMC 282767. PMID 3200828.
  45. ^ Pierce KE & Wangh LJ (2007). Linear-after-the-exponential polymerase chain reaction and allied technologies Real-time detection strategies for rapid, reliable diagnosis from single cells. Methods in Molecular Medicine. 132. pp. 65–85. doi:10.1007/978-1-59745-298-4_7. ISBN . PMID 17876077.
  46. ^ Krishnan, Madhavi; Ugaz, Victor; Burns, Mark (2002). "PCR in a Rayleigh-Benard convection cell". Science. 298 (5594): 793. doi:10.1126/science.298.5594.793. PMID 12399582.
  47. ^ Priye, Aashish; Hassan, Yassin; Ugaz, Victor (2013). "Microscale chaotic advection enables robust convective DNA replication". Analytical Chemistry. 85 (21): 10536–10541. doi:10.1021/ac402611s. PMID 24083802.
  48. ^ Schwartz JJ, Lee C, Shendure J (2012). "Accurate gene synthesis with tag-directed retrieval of sequence-verified DNA molecules". Nature Methods. 9 (9): 913–915. doi:10.1038/nmeth.2137. PMC 3433648. PMID 22886093.
  49. ^ Vincent M, Xu Y, Kong H (2004). "Helicase-dependent isothermal DNA amplification". EMBO Reports. 5 (8): 795–800. doi:10.1038/sj.embor.7400200. PMC 1249482. PMID 15247927.
  50. ^ Chou Q, Russell M, Birch DE, Raymond J, Bloch W (1992). "Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications". Nucleic Acids Research. 20 (7): 1717–1723. doi:10.1093/nar/20.7.1717. PMC 312262. PMID 1579465.
  51. ^ Kellogg, DE; Rybalkin, I; Chen, S; Mukhamedova, N; Vlasik, T; Siebert, PD; Chenchik, A (1994). "TaqStart Antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase". BioTechniques. 16 (6): 1134–7. PMID 8074881.
  52. ^ San Millan RM, Martinez-Ballesteros I, Rementeria A, Garaizar J, Bikandi J (2013). "Online exercise for the design and simulation of PCR and PCR-RFLP experiments". BMC Research Notes. 6: 513. doi:10.1186/1756-0500-6-513. PMC 4029544. PMID 24314313.
  53. ^ Zietkiewicz, E.; Rafalski, A.; Labuda, D. (1994). "Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification". Genomics. 20 (2): 176–83. doi:10.1006/geno.1994.1151. PMID 8020964.
  54. ^ Ochman H, Gerber AS, Hartl DL (1988). "Genetic Applications of an Inverse Polymerase Chain Reaction". Genetics. 120 (3): 621–623. PMC 1203539. PMID 2852134.
  55. ^ Mueller PR, Wold B (1988). "In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR". Science. 246 (4931): 780–786. Bibcode:1989Sci...246..780M. doi:10.1126/science.2814500. PMID 2814500.
  56. ^ Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (1996). "Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands". Proc Natl Acad Sci USA. 93 (13): 9821–9826. Bibcode:1996PNAS...93.9821H. doi:10.1073/pnas.93.18.9821. PMC 38513. PMID 8790415.
  57. ^ Isenbarger TA, Finney M, Ríos-Velázquez C, Handelsman J, Ruvkun G (2008). "Miniprimer PCR, a New Lens for Viewing the Microbial World". Applied and Environmental Microbiology. 74 (3): 840–9. doi:10.1128/AEM.01933-07. PMC 2227730. PMID 18083877.
  58. ^ Cenchao Shen; Wenjuan Yang; Qiaoli Ji; Hisaji Maki; Anjie Dong; Zhizhou Zhang (2009). "NanoPCR observation: different levels of DNA replication fidelity in nanoparticle-enhanced polymerase chain reactions". Nanotechnology. 20 (45): 455103. Bibcode:2009Nanot..20S5103S. doi:10.1088/0957-4484/20/45/455103. PMID 19822925.
  59. ^ Shen, Cenchao (2013). "An Overview of Nanoparticle-Assisted Polymerase Chain Reaction Technology". An Overview of Nanoparticle‐Assisted Polymerase Chain Reaction Technology. US: Wiley-Blackwell Publishing Ltd. pp. 97–106. doi:10.1002/9781118451915.ch5. ISBN .
  60. ^ Horton RM, Hunt HD, Ho SN, Pullen JK, Pease LR (1989). "Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap exten-sion". Gene. 77 (1): 61–68. doi:10.1016/0378-1119(89)90359-4. PMID 2744488.
  61. ^ Moller, Simon (2006). PCR: The Basics. US: Taylor & Francis Group. p. 144. ISBN .
  62. ^ David F, Turlotte E (1998). "Une méthode d'amplification génique isotherme" [An Isothermal Amplification Method]. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences, Série III. 321 (11): 909–914. Bibcode:1998CRASG.321..909D. doi:10.1016/S0764-4469(99)80005-5. PMID 9879470.
  63. ^ Fabrice David (September–October 2002). "Utiliser les propriétés topologiques de l'ADN: une nouvelle arme contre les agents pathogènes" (PDF). Fusion. Archived from the original (PDF) on 2007-11-28.(in French)
  64. ^ Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA (August 2011). "RNase H-dependent PCR (rhPCR): improved specificity and single nucleotide polymorphism detection using blocked cleavable primers". BMC Biotechnology. 11: 80. doi:10.1186/1472-6750-11-80. PMC 3224242. PMID 21831278.
  65. ^ Shyamala, V.; Ferro-Luzzi, Ames G. (1993). Single Specific Primer-Polymerase Chain Reaction (SSP-PCR) and Genome Walking. Methods in Molecular Biology. 15. pp. 339–48. doi:10.1385/0-89603-244-2:339. ISBN . PMID 21400290.
  66. ^ Bing DH, Boles C, Rehman FN, Audeh M, Belmarsh M, Kelley B, Adams CP (1996). "Bridge amplification: a solid phase PCR system for the amplification and detection of allelic differences in single copy genes". Genetic Identity Conference Proceedings, Seventh International Symposium on Human Identification. Archived from the original onسبعة May 2001.
  67. ^ Khan Z, Poetter K, Park DJ (2008). "Enhanced solid phase PCR: mechanisms to increase priming by solid support primers". Analytical Biochemistry. 375 (2): 391–393. doi:10.1016/j.ab.2008.01.021. PMID 18267099.
  68. ^ Raoult, D; G Aboudharam; E Crubezy; G Larrouy; B Ludes; M Drancourt (2000-11-07). "Molecular identification by "suicide PCR" of Yersinia pestis as the agent of medieval black death". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (23): 12800–12803. Bibcode:2000PNAS...9712800R. doi:10.1073/pnas.220225197. PMC 18844. PMID 11058154.
  69. ^ Y.G. Liu & R. F. Whittier (1995). "Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking". Genomics. 25 (3): 674–81. doi:10.1016/0888-7543(95)80010-J. PMID 7759102.
  70. ^ Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS (1991). Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification". Nucleic Acids Res. 19 (14): 4008. doi:10.1093/nar/19.14.4008. PMC 328507. PMID 1861999.
  71. ^ Myrick KV, Gelbart WM (2002). "Universal Fast Walking for direct and versatile determination of flanking sequence". Gene. 284 (1–2): 125–131. doi:10.1016/S0378-1119(02)00384-0. PMID 11891053.
  72. ^ "Full Text – LaNe RAGE: a new tool for genomic DNA flanking sequence determination".
  73. ^ Park DJ (2005). "A new 5' terminal murine GAPDH exon identified using 5'RACE LaNe". Molecular Biotechnology. 29 (1): 39–46. doi:10.1385/MB:29:1:39. PMID 15668518.
  74. ^ Park DJ (2004). "3'RACE LaNe: a simple and rapid fully nested PCR method to determine 3'-terminal cDNA sequence". BioTechniques. 36 (4): 586–588, 590. doi:10.2144/04364BM04. PMID 15088375.
  75. ^ "Key ingredient in coronavirus tests comes from Yellowstone's lakes". Science (in الإنجليزية). 2020-03-31. Retrieved 2020-05-13.
  76. ^ Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG (1971). "Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases". J. Mol. Biol. 56 (2): 341–361. doi:10.1016/0022-2836(71)90469-4. PMID 4927950.
  77. ^ Rabinow, Paul (1996). . Chicago: University of Chicago Press. ISBN .
  78. ^ Mullis, Kary (1998). . New York: Pantheon Books. ISBN .
  79. ^ Mullis, Kary (1990). "The unusual origin of the polymerase chain reaction". Scientific American. 262 (4): 56–61, 64–5. Bibcode:1990SciAm.262d..56M. doi:10.1038/scientificamerican0490-56. PMID 2315679.
  80. ^ Patidar, Madhvika; Agrawal, Suraksha; Parveen, Farah; Khare, Parul (2015). "Molecular insights of saliva in solving paternity dispute". Journal of Forensic Dental Sciences. 7 (1): 76–79. doi:10.4103/0975-1475.150325. PMC 4330625. PMID 25709326.
  81. ^ "Kary B. Mullis – Nobel Lecture: The Polymerase Chain Reaction".
  82. ^ "Citations for Chemical Breakthrough Awards 2017 Awardees". Division of the History of Chemistry. Retrieved 12 March 2018.
  83. ^ Saiki, R.; Scharf, S; Faloona, F; Mullis, K.; Horn, G.; Erlich, H.; Arnheim, N (1985). "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia". Science. 230 (4732): 1350–1354. Bibcode:1985Sci...230.1350S. doi:10.1126/science.2999980. PMID 2999980.
  84. ^ Advice on How to Survive the Taq Wars ¶2: GEN Genetic Engineering News Biobusiness Channel: Article. May 1 2006 (Vol. 26, No. 9).

وصلات خارجية

  • PCR Animation maxanim.com
  • OpenPCR Open-source PCR thermalcycler project
  • US Patent for PCR
  • OpenWetWare
  • What is PCR plateau effect? YouTube tutorial video
  • GeneWarrior Online PCR Primer design tool
  • History of the Polymerase Chain Reaction from the Smithsonian Institution Archives
  • Computer exercise. Design of PCR and PCR-RFLP experiments

نطقب:PCR

تاريخ النشر: 2020-06-09 15:57:21
التصنيفات: CS1 maint: multiple names: authors list, CS1 الإنجليزية-language sources (en), Interlanguage link template link number, بيولوجيا جزيئية, Polymerase chain reaction, Laboratory techniques, DNA profiling techniques, Amplifiers, Hoffmann-La Roche, تكنولوجيا حيوية, Molecular biology techniques, اختراعات أمريكية

مقالات أخرى من الموسوعة

سحابة الكلمات المفتاحية، مما يبحث عنه الزوار في كشاف:

آخر الأخبار حول العالم

قصف إسرائيلي استهدف فجراً جنوب دمشق

المصدر: ألشرق الأوسط - السعودية التصنيف: سياسة
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:23:12
مستوى الصحة: 83% الأهمية: 99%

نتائج أولية للجنة التحقيق: اقتحام الكونجرس شكل "ذروة محاولة

المصدر: مصراوى - مصر التصنيف: غير مصنف
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:22:28
مستوى الصحة: 59% الأهمية: 62%

«الصحة»: 932 إصابة جديدة بـ«كورونا».. وتعافي 659 حالة - أخبار السعودية

المصدر: صحيفة عكاظ - السعودية التصنيف: مجتمع
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:23:19
مستوى الصحة: 47% الأهمية: 67%

جوجل يحتفي بالطبيبة اللبنانية سنية حبوب بسبب إنجازاتها

المصدر: مصراوى - مصر التصنيف: غير مصنف
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:22:21
مستوى الصحة: 54% الأهمية: 63%

وزيرا الدفاع الصيني والأميركي سيجريان محادثات في سنغافورة

المصدر: ألشرق الأوسط - السعودية التصنيف: سياسة
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:23:07
مستوى الصحة: 88% الأهمية: 97%

مُلهمة نساء العرب.. من هي الطبيبة اللبنانية سنية حبوب والتي

المصدر: مصراوى - مصر التصنيف: غير مصنف
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:22:18
مستوى الصحة: 60% الأهمية: 61%

لجنة تحقيق أمريكية: تغريدة ترامب حفزت متطرفين على اقتحام الكونجرس

المصدر: اليوم السابع - مصر التصنيف: غير مصنف
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:22:14
مستوى الصحة: 39% الأهمية: 40%

أطباء بلا حدود تدق ناقوس الخطر للتحذير من أزمة سوء تغذية واس

المصدر: مصراوى - مصر التصنيف: غير مصنف
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:22:24
مستوى الصحة: 51% الأهمية: 54%

بريطانيا: مدينة ماريوبول الأوكرانية مهددة بتفشي الكوليرا

المصدر: ألشرق الأوسط - السعودية التصنيف: سياسة
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:23:09
مستوى الصحة: 78% الأهمية: 98%

العثور في بريطانيا على متحجرات «أكبر ديناصور مفترس» في أوروبا

المصدر: ألشرق الأوسط - السعودية التصنيف: سياسة
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:23:04
مستوى الصحة: 89% الأهمية: 93%

«الحج» تخفض أسعار باقات حجاج الداخل للعام الحالي - أخبار السعودية

المصدر: صحيفة عكاظ - السعودية التصنيف: مجتمع
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:23:17
مستوى الصحة: 59% الأهمية: 61%

السلطات الأميركية توسع التحقيق في نظام القيادة الآلية بسيارات «تسلا»

المصدر: ألشرق الأوسط - السعودية التصنيف: سياسة
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:23:11
مستوى الصحة: 91% الأهمية: 94%

النفط يتراجع مع تفاقم مخاوف الطلب بفعل إغلاق جزئي جديد في شنغهاي

المصدر: ألشرق الأوسط - السعودية التصنيف: سياسة
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:23:08
مستوى الصحة: 94% الأهمية: 91%

أوربان: حظر الغاز الروسي سيدمر الاقتصاد الأوروبي

المصدر: ألشرق الأوسط - السعودية التصنيف: سياسة
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:23:09
مستوى الصحة: 88% الأهمية: 89%

صحيفة أفريقية: صدمة مصر أمام إثيوبيا تسبب الذعر للفراعنة

المصدر: اليوم السابع - مصر التصنيف: غير مصنف
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:22:15
مستوى الصحة: 35% الأهمية: 39%

الأرصاد: درجات الحرارة أعلى من المعدلات الطبيعية وغدا الذروة

المصدر: اليوم السابع - مصر التصنيف: غير مصنف
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:22:14
مستوى الصحة: 33% الأهمية: 35%

الرئيس البولندي: التحدث مع بوتين مثل «التفاوض مع هتلر»

المصدر: ألشرق الأوسط - السعودية التصنيف: سياسة
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:23:11
مستوى الصحة: 89% الأهمية: 95%

أكثر من 19 ألف سوري يحصلون على الجنسية الألمانية عام 2021

المصدر: ألشرق الأوسط - السعودية التصنيف: سياسة
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:23:05
مستوى الصحة: 86% الأهمية: 96%

أنباء عن قتال عنيف في سيفيرودونيتسك الأوكرانية

المصدر: ألشرق الأوسط - السعودية التصنيف: سياسة
تاريخ الخبر: 2022-06-10 12:23:10
مستوى الصحة: 82% الأهمية: 96%

تحميل تطبيق المنصة العربية