وحدة تشكيل المستعمرات

في فهم الأحياء الدقيقة وحدة تشكيل المستعمرات ( CFU ، cfu ، Cfu ) هي وحدة تستخدم لتقدير عدد الخلايا الحية أولديها القدرة على الانقسام من البكتيريا أوالفطرية في العينة. يتم تعريف الخلايا الحية على أنها القدرة على التكاثر عبر الانقسام الثنائي في بيئة النمو. يحتاج العد باستخدام وحدة تشكيل المستعمرات إلى استنبات الميكروب في بيئة النمووعد الخلايا القابلة للانقسام فقط، على عكس الفحص المجهري الذي يعد جميع الخلايا حية أوميتة. يحتاج العد المظهري المرئي للمستعمرة في بيئة النموكثافة نموخلوي عالية، فعندما يتم عد المستعمراتقد يكون من غير المؤكد ما إذا كانت المستعمرة الواحدة قد نشأت من خلية واحدة أومجموعة من الخلايا، لذا يعد عد الخلايا بوحدة عد المستعمرات عملية غير دقيقة.

النظرية

يتم وضع التخفيف المصنوع من البكتيريا والماء الببتون أوالبروتين في طبق بيئة النمو( اطباق الأجار للعينات الغذائية أوأجار الصويا التريبتيزاز لعينات الطبية) حيث يتم نشر اللقاح على سطح الآجار باتباع النمط المشروح.

الغرض من عد الأطباق هوتقدير عدد الخلايا الموجودة بناءً على قدرتها على تكوين مستعمرات في ظروف معينة من المواد الغذائية ودرجة الحرارة والوقت. فهمياً يمكن لخلية واحدة قابلة للانقسام حتى تؤدي إلى مستعمرة من خلال التكرار. ومع ذلك المنظور الفهمي فإن الخلايا الانفرادية هي الاستثناء في الطبيعة، وعلى الأرجح حتى الخلايا السابقة للمستعمرة كانت تعبير عن كتلة من الخلايا المترسبة معًا. بالإضافة إلى ذلك تنموالكثير من البكتيريا في سلاسل (مثل البكتيريا العقدية ) أوكتل (مثل البكتيريا الكروية العنقودية ). في معظم الحالات يشير تقدير عدد الخلايا بواسطة وحدة تشكيل المستعمرة CFU إلى عدد الخلايا الحية فقط الموجودة في العينة، هذا لأن عد CFU يفترض حتى جميع مستعمرة منفصلة وتؤسس بواسطة خلية ميكروبية واحدة قابلة للانقسام.

عد الاطباق خطي في بكتيريا الـE. coli على مدى 30 إلى 300 CFU مستعمره في طبق بتري معياري الحجم. لذلك لضمان حتى تكون العينة في هذا النطاق، يحتاج تخفيف اللقاح بعدة تخفيفات. عادة ما يتم استخدام التخفيفات بعشرة أضعاف، ويتم تلقيح سلسلة للتخفيف بتكرار من 2 أوثلاثة على مدى التخفيفات المختارة. تتم قراءة عدد المستعمرات النامية على الطبق CFU في النطاق الخطي ثم يتم استنتاج العدد في الجرام الواحد CFU / g (أوالملليتر الواحد CFU / mL) ، مع مراعاة حجم الطبق وعامل التخفيف الخاص به.

غالبًا ما يتم تخفيف محلول البكتيريا ذات الهجريز غير المعروف بشكل تسلسلي من أجل الحصول على طبق واحد على الأقل قابل للعد من النموالبكتيري. في هذا الشكل ، فإن طبق "x10" الانسب للعد.

من مزايا هذه الطريقة حتى الأنواع الميكروبية المتنوعة قد تؤدي إلى ظهور مستعمرات مختلفة بشكل واضح عن بعضها البعض، سواء المجهرية أوالدقيقة . يمكن حتىقد يكون النمط الظاهري للمستعمرة ذا فائدة كبيرة في تحديد المخلوقات الحية الدقيقة الموجودة.

يمكن الفهم المسبق للتشريح المجهري للمخلوقات الحية حتى يقدم فهماً أفضل للعلاقة وحدة تشكيل المستعمرات CFU في المليلتر الواحد mL ، والذي ينسب إلى عدد الخلايا القابلة للانقسام لكل مليلتر. حيث التقليل من متوسط عدد الخلايا لكل CFU في بعض الحالات عن طريق مزج العينة قبل إجراء التخفيف. ومع ذلك، فإن الكثير من المخلوقات الحية الدقيقة حساسة وقد يتسبب مز النموقبل التخفيف في تقليل عدد الخلايا الحية والقابلة للانقسام في البيئة.

الترميز اللوغاريتمي

يمكن التعبير عن هجريز الوحدات المكونة للمستعمرة باستخدام الترميز اللوغاريتمي، حيث تكون القيمة المشروحة هي اللوغاريتم الأساسيعشرة للهجريز. يسمح ذلك بحساب لـ log reduction في عملية إزالة التلوث كوسيلة احصاء لعدد المستعمرات بشكل بسيط.

الاستخدامات

تُستخدم وحدة تشكيل المستعمرات لتحديد النتائج في الكثير من طرق عد الاطباق في الكثير من المخلوقات الحية الدقيقة، بما في ذلك:

طريقة صب الطبق : حيث يتم تلقيح بيئة نموسائلة في طبق بتري باستخدام أجار منصهر يتم تبريده إلى حوالي 40-45 °C (أعلى بقليل من نقطة التصلب ولتقليل من موت الخلايا الناجم عن الحرارة العالية). بعد ان يتصلب الأجار تحضن الأطباق في الظروف الملائمة.
طريقة النشر: حيث تنتشر العينة (بحجم صغير) على سطح طبق بيئة النموالأجار المغذي ويهجر إلى ان يجف قبل وضعه في الحضان.
كيفية الترشيح بالغشاء: حيث يتم ترشيح العينة من خلال مرشح غشائ، ثم يوضع المرشح على سطح طبق بيئة النموالأجار المغذي ( مع مراعاة وضع الجانب البكتيري لأعلى) ، حيث تتسرب العناصر المغذية خلال الفلتر لدعم الخلايا النامة خلال فترة التحضين. نظرًا لأن المساحة السطحية لمعظم المرشحات أقل من مساحة طبق بتري القياسي، فإن النطاق الخطي لعدد الأطباق سيكون أقل.
طرق Miles وMisra أوطريقة لوحة الإسقاط : حيث يتم إسقاط محتوى صغير جداً (عادة حواليعشرة microliters) من جميع التخفيفات في سلسلة على طبق بتري. يجب عد المستعمرات في هذه الحالة في بداية نموها لتجنب فقد جزء منها CFU أثناء نموها معًا.

مع التقنيات التي تتطلب استخدام أطباق النموفي الأجار المغذي، لا يمكن استعمال محلول بيئة سائلة لأنه لا يمكن تحديد نقاء العينة ولا يمكن حساب الخلايا واحدة تلوالأخرى في النموالسائل.

الأدوات المستخدمة في حساب المستعمرات

الكيفية التقليدية لعد المستعمرات CFUs بـ "عداد نقرات" وقلم. عندماقد يكون عدد المستعمرات أكبر من اللازم ، فمن الشائع عدّ المستعمرات CFU فقط على جزء صغير من الطبق.

يتم إجراء عد مستعمرات يدويًا باستخدام قلم وعداد نقرات. هذه طريقة بسيطة بشكل عام، ولكنها قد تكون شاقة جدًا وتستغرق وقتًا طويلًا عندما يتم عد الكثير من الأطباق. بدلاً من ذلك، يمكن استعمال حلول شبه آلية (برامج) وتلقائية (برامج + أجهزة).

برنامج حساب الـ CFUs

يمكن عد المستعمرات من صور الاطباق باستخدام أدوات برمجية. يأخذ المجربون عمومًا صورة لكل طبق يحتاجون إلى حسابها ثم تحليل جميع الصور (يمكن القيام بذلك باستخدام كاميرا رقمية بسيطة أوحتى كاميرا ويب). نظرًا لأنه يستغرق أقل منعشرة ثوانٍ لالتقاط صورة واحدة، بدلاً من عدة دقائق لحساب CFU يدويًا، فإن هذا النهج بشكل عام يوفر كثيرًا من الوقت. بالإضافة إلى ذلك، فهوأكثر موضوعية، حيث يسمح باستخراج المتغيرات الأخرى في المستعمرات مثل حجم ولون المستعمرة.

OpenCFU هوبرنامج مجاني ومفتوح المصدر مصمم لتحسين سهولة المستخدم والسرعة والمتانة. إنه يوفر مجموعة واسعة من المرشحات والتحكم وكذلك قابلات مستخدم حديثة. OpenCFU مكتوب بلغة C ++ ويستخدم OpenCV لتحليل الصور.
NICE هوبرنامج مكتوب في MATLAB يوفر طريقة بسيطة لحساب المستعمرات من الصور.
ImageJ وCellProfiler : يمكن استخدام بعض وحدات الماكروImageJ والإضافات وبعض خطوط أنابيب CellProfiler لحساب المستعمرات. غالبًا ما يحتاج ذلك من المستخدم تغيير الشفرة من أجل تحقيق تدفق عمل فعال، ولكن يمكن حتىقد يكون مفيدًا ومرنًا. إحدى المشكلات الرئيسية هي عدم وجود قابلة المستخدم الرسومية المحددة، التي يمكن حتى تجعل التفاعل مع خوارزميات المعالجة مملة.

بالإضافة إلى البرامج القائمة على أجهزة كمبيوتر سطح المخط التقليدية، تتوفر تطبيقات لأجهزة Android وiOS على حد سواء لحساب مستعمرة شبه آلية. تستخدم الكاميرا المدمجة لالتقاط صور لاطباق الأجار وإما حتى تستخدم خوارزمية داخلية أوخارجية لمعالجة بيانات الصورة ولتقدير عدد المستعمرات.

الأنظمة الآلية

تُستخدم الكثير من الأنظمة الآلية للتصدي الأخطاء البشرية ، حيث حتى الكثير من تقنيات البحث التي يقوم بها الأشخاص الذين يحسبون الخلايا الفردية لديهم فرصة كبيرة للخطأ. نظرًا لحقيقة حتى الباحثين يقومون يدويًا بحساب الخلايا يدويًا بمساعدة الضوء المنقول، يمكن حتىقد يكون لهذه التقنية المعرضة للخطأ تأثير كبير على الهجريز المحسوب في الوسط السائل الرئيسي عندما تكون الخلايا بأعداد قليلة.

عداد مستعمرات آلي باستخدام معالجة الصور.

الأنظمة الآلية بالكامل متوفرة أيضًا من بعض الشركات المصنعة للتقنية الحيوية. هي انظمة غالية الثمن بشكل عام وليست مرنة مثل البرامج المستقلة، نظرًا لأن الأجهزة والبرامج مصممة للعمل معًا من أجل إعدادات محددة. بدلاً من ذلك، تستخدم بعض الأنظمة الآلية نموذج الطبق ذوالسطح الحلزوني .

تسمح بعض الأنظمة الآلية مثل أنظمة MATLAB بحساب عدد الخلايا دون الحاجة إلى فرزها. وهذا بدوره يتيح للباحث إعادة استخدام المستعمرات في تجارب أخرى دون الحاجة لقتل الخلايا وفرزها. ومع ذلك، فإن العيب في مثل هذه الأنظمة يكمن في صعوبة التمييز بين الكائنات الحية الدقيقة من الغبار أوالخدوش على سطح طبق الآجار المغذي لأن كلا من الغبار والخدوش يمكن حتى تخلق مجموعة متنوعة للغاية من الشكل والمظهر.

وحدات بديلة

بدلاً من وحدة تشكل المستعمرات، يتم استخدام معامل معياري اخر مثل الرقم الأكثر احتمال (Most Probable Number) أووحدة Fishman المعدلة (Modified Fishman Units). تحسب طريقة الرقم الأكثر احتمالية الخلايا القابلة للانقسام، وهذه الطريقة مفيدة عند عد الهجريزات المنخفضة للخلايا أوعد الخلايا الميكروبية في المنتجات التي تكون فيها الجزيئات في عملية عد الأطباق غير فعالة. وحدات فيشمان المعدلة تأخذ في الاعتبار البكتيريا القابلة للانقسام، ولكن غير قابلة للاستزراع.

انظر أيضا

عد الخلايا
متوسطة النمو
طريقة ميلز وميسرا
العدد الأكثر احتمالا
طبق الاصل الطلاء
البلاك الفيروسي

المراجع

^ Goldman, Emanuel; Green, Lorrence H (24 August 2008). (الطبعة Second). USA: CRC Press, Taylor and Francis Group. صفحة 864. ISBN . مؤرشف من الأصل في 25 يناير 2020. اطلع عليه بتاريخ 16 أكتوبر 2014.
^ "The Number of Colonies Allowable on Satisfactory Agar Plates". Journal of Bacteriology. 1 (3): 321–31. May 1916. PMID 16558698. مؤرشف من الأصل في 16 ديسمبر 2019.
^ "Log10 Colony Forming Units per Gram". Titi Tudorancea Encyclopedia. مؤرشف من الأصل في 16 ديسمبر 2019. اطلع عليه بتاريخ 25 سبتمبر 2016.
^ Daniel Y. C. Fung (2009). "Viable Cell Counts". Bioscience International. مؤرشف من الأصل فيتسعة ديسمبر 2018. اطلع عليه بتاريخ 25 سبتمبر 2016.
^ Martin Cole (November 1, 2005). "Principles of microbiological testing: Statistical basis of sampling" (PDF). International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). مؤرشف من الأصل (PDF) في 31 أكتوبر 2017. اطلع عليه بتاريخ 25 سبتمبر 2016.
^ Reynolds, Jackie. "Serial Dilution Protocols". www.microbelibrary.org. مؤرشف من الأصل في 17 نوفمبر 2015. اطلع عليه بتاريخ 15 نوفمبر 2015.
^ Geissmann Q (2013). "OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects". PLoS ONE. 8 (2): e54072. doi:10.1371/journal.pone.0054072. PMID 23457446.
^ https://www.nist.gov/pml/div686/sources_detectors/nice.cfm^{[استشهاد ناقص]}
^ "Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies". Cytometry Part A. 77 (8): 790–7. August 2010. doi:10.1002/cyto.a.20864. PMID 20140968.
^ "Optimized digital counting colonies of clonogenic assays using ImageJ software and customized macros: comparison with manual counting". International Journal of Radiation Biology. 87 (11): 1135–46. November 2011. doi:10.3109/09553002.2011.622033. PMID 21913819.
^ Using CellProfiler for automatic identification and measurement of biological objects in images. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 14. April 2008. صفحات Unit 14.17. doi:10.1002/0471142727.mb1417s82. ISBN . PMID 18425761.
^ "Promega Colony Counter". App Store (باللغة الإنجليزية). مؤرشف من الأصل في 29 سبتمبر 2018. اطلع عليه بتاريخ 28 سبتمبر 2018.
^ "APD Colony Counter App PRO - Apps on Google Play". play.google.com (باللغة الإنجليزية). مؤرشف من الأصل في 25 يناير 2020. اطلع عليه بتاريخ 28 سبتمبر 2018.
^ Austerjost, Jonas; Marquard, Daniel; Raddatz, Lukas; Geier, Dominik; Becker, Thomas; Scheper, Thomas; Lindner, Patrick; Beutel, Sascha (August 2017). "A smart device application for the automated determination of E. coli colonies on agar plates". Engineering in Life Sciences (باللغة الإنجليزية). 17 (8): 959–966. doi:10.1002/elsc.201700056. ISSN 1618-0240.
^ "CFU Scope". App Store (باللغة الإنجليزية). مؤرشف من الأصل في 29 سبتمبر 2018. اطلع عليه بتاريخ 28 سبتمبر 2018.
^ "Colony Counters: Robotic Colony Counter - Plate Handler". www.neutecgroup.com (باللغة الإنجليزية). مؤرشف من الأصل في 16 ديسمبر 2019. اطلع عليه بتاريخ 28 سبتمبر 2018.
^ "Fully Automatic Colony Counter by AAA Lab Equipment Video | LabTube". www.labtube.tv. مؤرشف من الأصل في 28 نوفمبر 2018. اطلع عليه بتاريخ 28 سبتمبر 2018.
^ Brugger, Silvio D.; Baumberger, Christian; Jost, Marcel; Jenni, Werner; Brugger, Urs; Mühlemann, Kathrin (2012-03-20). "Automated Counting of Bacterial Colony Forming Units on Agar Plates". PLoS ONE. 7 (3): e33695. doi:10.1371/journal.pone.0033695. ISSN 1932-6203. PMID 22448267.
^ "Bacterial Analytical Manual: Most Probable Number from Serial Dilutions". United States إدارة الغذاء والدواء. October 2010. مؤرشف من الأصل في 23 أبريل 2019.