في التقنيات الحيوية، اللطخة الغربية بالإنگليزية: Western Blot (تعهد أيضا باللطخة المناعية Immunoblot) هي طريقة اكتشاف بروتين معين في عينة أومستخلص أنسجة، وهي من التقنيات الحيوية المخبرية. تستخدم الفصل الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الطبيعية native proteins أوالبروتينات المُتَمَسِّخة denatured proteins حسب طول السلاسل البروتينية (ظروف مفككة) أوحسب الشكل الثلاثي الأبعاد للبروتين (ظروف قومية/غير مفككة). يتم، في ما بعد، نقل البروتينات إلى غشاء (عادة ماقد يكون الغشاء مصنوعا من مادة النيتروسليولوز أوPVDF)، حيث يتم التحقق (الاكتشاف) باستخدام أضداد مخصصة للبروتين الهدف. هناك الآن الكثير من شركات المواد التي تتخصص في تجهيز أضداد (مستنسخة ومتعددة النسائل) ضد آلاف البروتينات المتنوعة. وقد أذى ذلك إلى تقليل الوقت الذي تحتاجه لعمل لطخة بصورة كبيرة.

كان يجب، سابقًا، تلقيح الحيوانات الكبيرة (مثل: الخرفان، العنز - يحتويان على الكثير من المصل) بالبروتين المستهدف مرتين (حيث حتى الاستجابة المناعية الثانية تنتج أضدادا أكثر). ومن ثم إما يتم تصفية المصل واستخدامه (أضداد متعددة النسائل - Polyclonal -) أويمكن فصل الخلايا البائية من الحيوان ودمجها خارج الجسم in vitro مع خلايا فأر سرطانية لتوليد خلايا هيبريدوما التي تستطيع في ما بعد إنتاج أضداد وحيدة النسيلة (Monoclonal).

الأضداد التجارية عادة ما تكون مكلفة، ولكن يمكن إعادة استخدامها (استخدام ما يتبقى من الأجسام المضادة غير الملتصقة) بين التجارب. هذه الكيفية تستخدم في الأحياء الجزيئية، الكيمياء الحيوية، وفهم الجينات المناعية Immunogenetics وعدة أخرى من علوم الأحياء الجزيئية.

من التقنيات الأخرى المتعلقة هي استخدام الأجسام المضادة لاكتشاف البروتينات في الأنسجة أوالخلايا باستخدام الصبغة المناعية Immunostaining والإلايزا ELISA.

تم خلق هذه الطريقة في مختبر جورج ستارك في جامعة ستانفورد عام 1981. قام وولتر نيل بورنيت بتسميتها باسم "اللطخة الغربية"، وهومشتق من اسم اللطخة الجنوبية (Southern Blot بالإنكليزية، من Southern وهي نسبة إلى إدون ساذرن Edwin Southern، والتي تعني أيضا الجنوبي بالإنكليزية. فسميت التقنية الجديدة بـالغربية، تلاعبا بالمعنى). واللطخة الجنوبية تقنية لاكتشاف الحمض الريبي النووي منقوص الأكسجين DNA، قام إدون ساذرن Edwin Southern بصنعها عام 1975. تسمى طريقة اكتشاف الحمض الريبي النووي RNA باسم اللطخة الشمالية.

خطوات اللطخة الغربية

تحضير الأنسجة

يمكن أخذ العينات من أنسجة كاملة أومن زراعة الخلايا. يتم كسر الأنسجة الصلبة ميكانيكيًا، في أغلب الأحيان، باستخدام خلاّط (لأحجام عينات كبيرة)، باستخدام مجنس homogenizer (للأحجام الأصغر)، أوبالصوتنة Sonication. يمكن كسر وفتح الخلايا بإحدى الطرق المذكورة أعلاه أيضًا.

يمكن توظيف الكثير من المنظفات والأملاح والمحاليل لتشجيع التكسر الخلوي ولإذابة البروتينات. يتم أيضًا إضافة مثبطات (موانع) البروتييزات والفسفاتيزات Protease and Phosphatase Inhibitors وذلك لمنع تآكل العينة بإنزيماتها الخاصة.

يتم استخدام مجموعة من التقنيات الميكانيكية والكيمياحيوية (البايوكيميائية) من ضمنها أيضًا الكثير من أنواع التصفية والطرد المركزي لفصل أجزاء أوعضيات معينة من الخلايا.

الفصل الكهربائي للهلام

يتم فصل بروتينات العينة باستخدام الفصل الكهربائي. فصل البروتينات قد يحدث باستخدام النقطة متوازنة الكهربة Isoelectric point (pI)، الوزن الجزيئي، الشحنة الكهربائية، أومجموعة من هذه العوامل. طبيعة الفصل تعتمد على طريقة معالجة العينة وطبيعة الهلام.

إلى حد الآن، الطريقة الأكثر شيوعاً للفصل الكهربائي للهلام توظف هلامات متعدد الأكريلامايد polyacrylamide ومحاليل تحتوي على كبريتات دوديكل الصوديوم Sodium Dodecyl Sulfate (SDS).

SDS-PAGE أي (الفصل الكهربائي لهلام كبريتات دوديكل الصوديوم متعددالأكريلامايد SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) تحافظ على سلسلة البروتيات في حالة مفككة denatured state حالماً يتم معالجتهم مع عوامل اختزال قوية للقضاء على الأشكال الثانوية والثالثية. (مثل تحويل الروابط ثنائية الكبريت S-S إلى SH وSH) وبذلك يسمح لفصل البروتينات حسب وزنهم الجزيئي. يتم تغطية البروتينات في العينة بكبريتات دوديكل الصوديوم السالبة الشحنة ونقلها إلى القطب الكهربائي الموجب الشحنة خلال شبكة الأكريلامايد في الهلام. البروتينات الصغيرة تهاجر أسرع خلال هذه الشبكة وبذلك يتم فصل البروتينات حسب الحجم (عادة ما يتم قياسها بالكيلودالتون، kD، kiloDaltons). هجريز الأكريلامايد يحدد دقة الهلام - حدثا زاد هجريز الأكريلامايد حدثا زادت دقة البروتينات ذات الأوزان الجزيئية العالية. البروتينات تهاجر ببعد واحد خلال الهلام لأغلب اللطخات.

يتم تحميل العينات في آبار في الهلام. يتم حفظ إحدي الأسطر للـ درج أوالعلامات، وهما خليط متوفر تجارياً من عدة بروتينات معروفة الوزن الجزيئي، عادة ما تكون مصبوغة لكي تُظهر حزم ملونة مرئية. أحد الأمثلة على الدرج، هودرج الأوزان الجزيئية الكامل المدى لشركة GE (كما في الشكل). عندما يتم تطبيق فرق الجهد على الهلام، تهاجر البروتينات ضمنه بسرع مختلفة. هذه المعدلات الزمنية المتنوعة للتقدم (حركات الفصل الكهربائي المتنوعة) تُفصل إلى حُزم ضم جميع سطر.

من الممكن أيضاً استخدام الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد الذي يفصل البروتينات من عينة واحدة في بُعدين. البروتينات تفصل بحسب النقطة متوازنة الكهربة (هجريز أيونات الهيدروجين pH الذي تكون فيه الشحنة متعادلة) في البعد الأول، وبحسب الوزن الجزيئي في البعد الثاني.

النقل

من أجل جعل الوصول للبروتينات أسهل للأكتشاف بالأجسام المضادة، يتم نقلهم من الهلام إلى غشاء مصنوع من النيتروسيليوز أوالـPVDF. يتم وضع هذا الغشاء فوق الهلام، ووضع مجموعة من طبقات أوراق الترشيح فوق ذلك. ثم يتم وضع الطبقات كلها في محلول يقوم بالتنقل إلى الأعلى عبر الأوراق بالخاصية الشعرية Capillary action، جالباً البروتينات معه إلى الغشاء.

ومن الطرق الأخرى لنقل البروتينات تدعى اللطخة الكهربائية وتستخدم تياراً كهربائي لسحب البروتينات من الهلام إلى الغشاء.

البروتينات الآن نُقلت من داخل الهلام إلى سطح غشاء من النيتروسيليلوز أوPVDF مع ثباء الترتيب التي كانت البروتينات عليه داخل الهلام. ويكون ناتج هذه العملية، هوعرض البروتينات على سطح رقيق للاكتشاف (انظر أسفلاً). كلا نوعي الغشاء (نيتروسيليلوز أوPVDF) يتم اختيارهم لخاصية الالتصاق غير المحدد بالبروتيات (أي أنهم يلتصقون بأي بروتين بصورة متساوية). التصاق البروتينات مبني على تفاعلات مصابة بفوبيا الماء hydrophobic interactions)، بالإضافة إلى التفاعلات المشحونة بين الغشاء والبروتين. إذا أغشية النيتروسيليلوز تكون أقل كلفة من الـ PVDF، ولكنهم هشة أكثر ولا تستطيع الوقوف لتحقيقات مجددة reprobes كثيرة.

التأثير الكلّي والموحّد لنقل البروتين من الهلام إلى الغشاء يمكن التأكد منه بصبغ الغشاء بصبغة كوماسي Coomassie أوبونسوس Ponceau S. كوماسي هي الصبغة الأكثر حساسية من الصبغتين، بالرغم من حتى سهولة ذوبان بونسوس في الماء تجعله أسهل للإزالة لاحقاً والتحقق من الغشاء كما في أدناه.

السد

بما أنه تم اختيار الغشاء لقابليته على الالتصاق بالبروتينات، وكلاً من الأجسام المضادة والأهداف هما بروتينات، يجب إتخاذ إجراءات خاصة لمنع التفاعلات بين الغشاء والجسم المضاد المستخدم لاكتشاف البروتين الهدف. يتم سد الالتصاق غير المحدد عن طريق وضع الغشاء في محلول مخفف من بروتين - عادة ماقد يكون هذا البروتين هوألبومين مصل البقر Bovine Serum Albumin المعروف بالـ BSA أوحليب من غير دهون (كلاهما ليسا مكلفان)، مع مقدار صغير من منظف مثل توين 20 Tween. البروتين في المحلول المخفف يلتصق بالغشاء في جميع الأماكن الغير محتوية على البروتينات الهدف. وبهذا، عندما يتم إضافة الجسم المضاد، لنقد يكون هناك مكان له ليلتصق غير على مواقع الالتصاق على البروتين الهدف المحدد. هذا يقلل "التشويش" في النتيجة النهائية لللطخة الغربية، ويؤدي إلى نتائج أوضح، ويقضي على النتائج الإيجابية المزيفة.

الاكتشاف

خلال عملية الاكتشاف، يتم التحقق من وجود البروتين المطلوب على الغشاء عن طريق جسم مضاد معدل مرتبط بإنزيم مراسل، الذي عند وضع مادة معينة عليه يسبب تفاعل لوني ويقوم بإنتاج لون معين. ولعدة أسباب، فإن هذه المستوى تتم بخطوتين، بالرغم من حتى الآن يوجد طرق اكتشاف ذات خطوة واحدة لبعض الاستخدامات.

الخطوتين

• الجسم المضاد الأولي

يتم تكوين الأجسام المضادة عندما يتم عرض البروتين المطلوب (أوجزءاً منه) على المستضيف أوخلايا المناعة المزروعة. عادةً،قد يكون هذا جزءاً من الإستجابة المناعية، ولكن هنا يتم حصد الأجسام المضادة واستخدامها كأدوات اكتشاف دقيقة وحساسة تلتصق بالبروتين مباشرة.

بعد عملية السد، يتم احتضان الغشاء في محلول مخفف من الجسم المضاد الأولي (عادة بهجريز بين 0,5 ميكروغرام/مل إلىخمسة ميكروغرام/مل) مع التحريك الخفيف. بشكله النموذجي، يحتوي المحلول على محاليل ملحية مع نسبة صغيرة من المنظفات، وأحياناً مسحوق حليب أوألبومين مصل البقر BSA. يمكن وضع محلول الجسم المضاد والغشاء معاً وإحتضانهما لأي فترة بين 30 دقيقة إلى عبر الليل. ويمكن أيضاً إحتضانهما في درجات حرارة مختلفة، حيث تكون الدرجات الدافئة أكثر محفزة على الالتصاق (لكلا نوعي الالتصاق، الالتصاق المحدد والإلتصاق الغير محدد "التشويش").

• الجسم المضاد الثانوي

بعد تنقيع الغشاء أوغسله لإزالة الأجسام المضادة الأولية الغير ملتصقة، يتم إضافة جسم مضاد آخر للغشاء، موجه نحوجزء خاص-لنوع species-specific الجسم المضاد الأولي. وهذا يعهد بالجسم المضاد الثانوي، وبسبب خواصه المستهدِفة، يتم تسميته بـ"ضد-الفأر"، "ضد-العنز"، "ضد-الجرذ"، الخ. الأجسام المضادة تأتي من مصادر الحيوانات (أوزراعة خلايا هيبريدوما حيوانية)؛ فالجسم المضاد الثانوي ضد-الفأر سيلتصق لأي جسم مضاد أولي مصدره الفأر. وهذا يسمح لتوفير المصاريف بالسماح لكل المختبر من استخدام مصدر واحد من جسم مضاد منتج بكثرة، ويوفر نتائج منسقة أكثر بكثير. عادة ماقد يكون الجسم المضاد الثانوي مرتبط بجزيئة بايوتين أوإلى إنزيم مراسل مثل فسفاتاز قلوي Alkaline phosphatase أوبيروكسيداز الفجل الحار Horseradish peroxidase. هذا يعني حتى عدة أجسام مضادة ثانوية ستلتصق بجسم مضاد أولي واحد وتقوم بتعزيز الإشارة للاكتشاف.

غالباً ما يتم استخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط ببيروكسيداز الفجل مع عامل مضيء كيميائي، وينتج التفاعل بينهما ضوءاً بمقدار كمية البروتين. يتم استخدام طبقة حساسة من الفيلم الفوتوغرافي لخلق صورة للأجسام المضادة الملتصقة باللطخة.

كما في إجراءات الإيلايزا الإيلايزبوت، يمكن تزويد الأنزيم بجزيئة التي يحولها الإنزيم إلى ناتج تفاعل ملون يمكن رؤيته على الغشاء.

البديل الثالث هواستخدام علامة مشعة بدل إنزيم متصل بالجسم المضاد الثانوي، مثل ربط بروتين يلتصق بالأجسام المضادة (مثل بروتين أ من العنقودية Staphylococcus) بنظير مشع من اليود. ولكن بما أنه الطرق الأخرى هي أكثر أماناً، وأسرع وأرخص، قلّ ما يتم استخدام هذه الطريقة الآن.

المستوى الواحدة

تأريخياً، كانت عملية التحقق تُجرى بخطوتين وذلك بسبب السهولة النسبية لإنتاج أجسام مضادة أولية وثانوية من ناحية المرونة، وأيضاً يضيف خطوة تكبير للإشارة لعملية الاكتشاف.

نظراً للقدرة الإنتاجية العالية لتحليل البروتينات وإنخفاض حدود الإشارة المطلوبة للكشف، تم تطوير طرق تحقُّق ذات خطوة واحدة والتي تستطيع حتى تحدث بصورة أسرع مع تقليل استخدام المستهلكات. وهذا يحتاج جسم مضاد ملتقط الذي يتعهد على البروتين المطلوب ويحتوي على علامات اكتشاف/التقاط، وغالباً ماقد يكون هناك ملتقطات للبروتينات المؤشرة Protein tags. يتم احتضان الملتقط الأولي مع الغشاء بطريقة مماثلة للجسم المضاد الأولي في طريقة الخطوتين، ومن ثمقد يكون جاهز للكشف بعد سلسلة من خطوات الغسل.

التحليل

بعد حتى يتم غسل الملتقطات الغير ملتصقة، يصبح اللطخة الغربية جاهز للاكتشاف عن طريق الملتقطات الملتصقة بالبروتين المراد اكتشاف وجوده أوعدمه. في المصطلحات العملية، لا تُظهر جميع اللطخات الغربية البروتين بصورة حزمة واحدة فقط على الغشاء. يتم أخذ تقديرات الحجم عن طريق مقارنة الحزم المكتشفة بحزم الدرج المصبوغة التي تم تحميلها عند خطوة الفصل الكهربائي. يتم إعادة هذه العملية لبروتين هيكلي، مثل الأكتين أوالتيوبيولين، الذي لا يجب تغيير هجريزه بين العينات. كمية البروتين الموجودة تتم مقارنتها بالبروتين الهيكلي لكي يتم السيطرة على المجموعات العدة. هذه الكيفية تؤكد تسليم التغييرات الدارجة بسبب عدم انتنطق البروتين أووجود أخطاء في التجربة.

الاكتشاف اللوني Colorimetric detection

طريقة الاكتشاف اللوني تعتمد على احتضان اللطخة الغربية مع المادة التي ستتفاعل مع الإنزيم المراسل (مثل البيروكسيداز Peroxidase) الذيقد يكون مرتبط بالجسم المضاد الثانوي. هذا يحول الصبغة الذائبة إلى شكل غير ذائب بلون مختلف والتي تترسب قرب الإنزيم وبالتالي تصبغ غشاء النيتروسيليلوز. يتم إيقاف تحميض اللطخة عندها عن طريق غسل الصبغة الذائبة. يتم تحليل كمية البروتينات باستخدام قياس الكثافة densitometry (أي ما هي كثافة البقعة/الصبغة) أوقياس الضوء spectrophotometry.

الإضاءة الكيميائية Chemiluminescence

تعتمد طريقة الاكتشاف بالإضاءة الكيميائية على احتضان اللطخة الغربية مع المادة التي تضيء عندما تتصل بالجزيء المراسل على الجسم المضاد الثانوي. وعندها يتم التقاط الضوء باستخدام فيلم فوتوغرافي، ومؤخراً باستخدام كاميرات سي سي دي CCD cameras تلتقط صورة رقمية لللطخة الغربية. هذه الصورة يتم تحليلها باستخدام مقياس الكثافة الذي يحلل كمية الصبغة البروتينية النسبية ويقوم بالتحليل الكمي عن طريق الكثافة الضوئية. يوجد برامج جديدة تساعد على تحليلات البيانات بصورة أخرى مثل تحليل الوزن الجزيئي إذا تم استخدام مقاييس سليمة. يعتبر ما يسمى بالمضيء الكيميائي المحسن Enhanced chemiluminscent أوECL هومن ضمن أكثر الطرق حساسية للاكتشاف التحليلي لللطخة الغربية.

الاكتشاف المشع Radioactive detection

العلامات المشعة لا بحاجة إلى مواد إنزيمية، ولكن فقط وضع أفلام أشعة سينية طبية مباشرة على اللطخة الغربية والذي يقوم بخلق أجزاء غامقة على الفيلم تعود إلى حزم البروتينات المطلوب كشفها (انظر الصورة). قلت أهمية طرق الاكتشاف المشع، بسبب كونها مكلفة، ولها أخطار صحية عالية، كما حتى المضيء الكيميائي المحسن ECL يعتبر بدل مفيد جداً.

الاكتشاف الفلوري Fluorescent detection

يتم تحفيز الملتقط ذوالعلامات الفلورية بواسطة الضوء والانبعاث من التحفيز وبذلك يتم الاستدلال عليه بواسطة متحسس ضوئي مثل كاميرا سي سي دي المزودة بمرشح باعث مناسب حيث يقوم بألتقاط الصورة الرقمية لللطخة الغربية ويقوم بالسماح لتحليل بيانات أخرى كالوزن الجزيئي والتحليل الكمي لللطخة الغربية. يعتبر الملتقط الفلوري من بين أكثر الطُرق حساسية لتحليل اللطخة.

التحقق الثانوي

أحد الاختلافات الكبيرة بين غشائي النيتروسيليلوز وPVDF يعود إلى قابلية جميع منهم على القيام بـ"تعرية" للأجسام المضادة وإعادة الاستخدام لأجسام مضادة ملتقطة لاحقاً. وبالرغم من حتى هناك طرق مختبرة لتعرية أغشية النيتروسيليلوز، تظل أغشية الـPVDF أسهل تعرية، وتسهل استخدام أكثر قبل حتى يقوم التشويش الخلفي بإعاقة التجارب. أحد الاختلافات الأخرى هو، بعكس النيتروسيليلوز، الـPVDF يجب حتى ينقع في 95% إيثانول، بروبانول أوميثانول قبل الاستخدام. أغشية الـPVDF أيضاً تكون أكثر سمكاً وأكثر مقاومة للضرر خلال الاستخدام.

الفصل الكهربائي للهلام ببعدين

2D-SDS-PAGE ثنائي الأبعاد يستعمل المبادئ والتقنيات المُشار إليها اعلاه. كما يشير الاسم، فإن هذه الكيفية تضم هجرة سلسلة البروتينات في بعدين. في البُعد الأول تقوم السلسلة البروتينية بالأنفصال حسب نقطة التعادل الكهربي. أما في البعد الثاني تنفصل السلسلة البروتينية حسب وزنها الجزيئي. تُقاس نقطة التعادل الكهربي لبروتين مُعين بواسطة الرقم النسبي للأحماض الأمينية الموجبة (كاللايسين) والسالبة (كالگلوتاميت), وتقوم الأحماض الأمينية السالبة بتزويد أعلى نقطة تعادل كهربي, ومن جهة أخرى تقوم الأحماض الامينية الموجبة بتزويد أقل نقطة تعادل كهربي.

تسمح هذه الطريقة بفصل جميع البروتينات الخلوية على هلام مفرد وكبير. من الفوائد المهمة لهذه الطريقة هي التمييز بين الأشكال المُختلفة لبروتين مُعين (مثلاَ البروتين الذي تمت فسفرتهُ، أي إضافة المجموعة السالبة الشُحنة). يُمكن بتر البروتين الذي تم فَصله من الهُلام وبعدها يتم تحليله بواسطة جهاز تحليل الكتلة mass spectrometry الذي يقوم باكتشاف البروتين وتحديد هويته.

الاستخدامات في الفحص الطبي

• إحدى اختيارات الكشف على فيروس نقص المناعة البشرية توظف اللطخة الغربية لاكتشاف الجسم المضاد للفيروس HIV في عينة مصل الإنسان. بروتينات من خلايا معروفة الإصابة بفيروس HIV يتم فصلها وبقعها على غشاء كما في أعلاه. ثم، يتم تجربة المصل بصورة جسم مضاد أولي؛ ثم يتم غسل الأجسام المضادة غير الملتصقة، ويتم وضع جسم مضاد ثانوي ضد-بشري مرتبط بإنزيم الإشارة. الحزم المصبوغة تدل على البروتينات التي تتعهد عليها الأجسام المضادة في مصل المريض.

• يتم أيضاً استخدام اللطخة الغربية كاختيار مؤكد لسقم جنون البقر (Bovine spongiform encephalopathy (BSE.

• يتم استخدام اللطخة الغربية لاختيار بعض أنواع سقم لايم Lyme disease (الذي هوالتهاب بكتيري).

الطرق

• طريقة مختبر الدكتور مارك بارتون فرانك

المصادر

• ويكيبيديا

انظر أيضاً

• ضد (مناعة)
• SDS-page
• سلم الدنا
• اختبار المذنب

روابط متعلقة

• تحليل اللطخة الغربية لعينات داخل-الخلية المفصولة، باستخدام جهار تصوير أوديسي بالأشعة تحت الحمراء
• طريقة اللطخة الغربية بضمنه أمثلة على المحاليل وطرق إعادة التحقق
• فيديوفي يوتيوب يظهر تقنية اللطخة الغربية

نطقب:المسابر الجزيئية