كريسبر أوالتكرارات العنقودية المتناظرة القصيرة منتظمة التباعد (بالإنجليزية: دنا توجد في بدائيات النوى كالبكتيريا والبكتيريا القديمة، فيها فواصل مقتطعة من بقايا الحمض النووي للفيروسات التي تجاوز حتى هاجمت الكائن بدائي النواة. يحتفظ الكائن بدائي النواة بهذه البقايا في حمضه النووي كفواصل حتى يستخدمها لاحقاً في الكشف عن الدنا الخاص بتلك الفيروسات في هجماتها اللاحقة، ومن ثم تدميره بمساعدة بروتين cas9.

كاس9 أوالبروتين المتعلق بكريسبرتسعة (بالإنجليزية: cas9 or CRISPR-associated protein 9) هوأنزيم قاطع يستخدِم تسلسلات كريسبر كدليل للتعهد على سلاسل معينة من الدنا للكائنات الأخرى (مثل الفيروسات المهاجمة للبكتيريا) ومن ثم قصها. وبالتالي تشكل تسلسلات CRISPR مع بروتين cas9 آلية دفاع جزيئية مهمة في بدائيات النوى ضد الفيروسات المهاجمة لها.

وقد قام الإنسان حديثا بالاستفادة من هذا النظام البكتيري الطبيعي، واستخدامه في التعديل على جينومات الكائنات الحية عن طريق قص أجزاء من حمضها النووي بسهولة، في ما يعهد الآن بتقنية كريسبر-كاس9 التي تستخدم في مجال واسع من التطبيقات كالأبحاث الفهمية الحيوية والطبية، وتطوير منتجات التقانة الحيوية وعلاج الأمراض.

تاريخ كريسبر

اكتشفت مناطق كريسبر لأول مرة من قبل فهماء يابانيين من جامعة أوساكا عام 1987 حين كانويدرسون جينات معينة في بكتيريا E. Coli، حيث قاموا دون قصد بتحديد تسلسل منطقة من الحمض نووي تقع بالقرب من جين ضمته الدراسة، تحتوي على عدد كبير من تكرارات تسلسلات متناظرة بينها فواصل، لكن لم تكن الغاية منها معروفة حينها. لاحقا تم اكتشاف هذا النمط في أنواع أخرى من البكتيريا الحقيقية والبكتيريا القديمة. ثم طُرِح عام 2005 حتى CRISPR هي جزء من النظام المناعي البكتيري. في عام 2007، كان الفهماء يدرسون البكتيريا العقدية المنتجة لحمض اللبن Streptococcus thermophilus وآليات مقاومتها لهجمات الفيروسات، حيث كانت هجمات هذه الفيروسات من أكبر المشاكل التي تقابل صناعات الألبان والأجبان، فوجدوا حتى كريسبر هي وسيلة مناعة تكيفية (مكتسبة) تستخدمها البكتيريا عند تعرضها للهجمات الفيروسية.

بعد البحث الدقيق عام 2011 في آلية عمل نظام كريسبر تبين للفهماء أنه من الممكن هجريب أي سلسلة من الحمض النووي guide RNA على إنزيم cas9. عندما عملوا ذلك، وبالتدقيق في عام 2013، صار بالإمكان استخدام الإنزيم للبحث عن أي DNA له نفس تسلسل الـgRNA الذي يحمله، وليس فقط في الفيروسات. وبذلك أصبح بإمكان الفهماء التعديل على جينوم أي كائن حي، بقص الحمض النووي الوراثي له بشكل مرن وأكثر سهولة من باقي تقنيات التعديل الوراثي، حتى أصبحت أكثر طرق تعديل الجينوم انتشارا. ويطلق الآن عادة اسم تقنية كريسبر على نظام البتر هذا والمكون من الجزأين: بروتين البتر cas9 والـgRNA.

كريسبر في بدائيات النوى

كريسبر-كاس كآلية دفاع

وُجد حتى تسلسلات كريسبر هي وسيلة مناعية تكيفية تستخدمها بدائيات النوى كالبكتيريا ضد العناصر الجينية الدخيلة (مثل البلازميدات والفاجات) التي يتعرض لها الكائن بدائي النواة. فمثلا، عندما يصيب فيروس بكتيريوفاج بكتيريا فإنه يحقن حمضه النووي DNA داخل البكتيريا، ليتكاثر داخل البكتريا بأعداد كبيرة قد تقتلها. عندها تطلق البكتيريا أنزيمات لتقوم بجمع بتر من الحمض النووي لذلك لفيروس، ومن ثم تخزين تلك الشيفرة في كريسبر، عن طريق إضافة وحذف بتر من الحمض النووي الفاصل في منطقة كريسبر، الذي وُجد أنه يطابق أجزاء من الشيفرة الوراثية الخاصة بالفيروس. وبذلك، عند تعرض البكتيريا لفيروس مماثل مرة أخرى، تقوم البكتيريا بنسخ الحمض النووي المخزن في كريسبر على هيئة RNA، يسمى crRNA. يقترن crRNA ببروتين البتر cas9، حيث يستخدمه cas9 للتعهد على الفيروس. وعندما يلتقي إنزيم cas9 بفيروس، فإنه وبكيفية تبدووكأنه يمتطي سلسلتي الـDNA الخاصة بالفيروس يبحث عن تطابق بين جزء من الـcrRNA الذي يحمله وبين الحمض النووي الخاص بالفيروس. هذا الجزء من crRNA الذي يستخدم في التعهد على الفيروسقد يكون طوله 20 نيوكلوتيد تقريبا. فإذا تطابقت الـ20 نيوكليوتايد التي يحملها cas9 مع 20 نيوكليوتايد من DNA الفيروس، تنفك سلسلتي الـDNA، ما يحفز cas9 لبتر سلسلتي DNA الخاصة بالفيروس، مسبباً تدميره.

هجريب منطقة كريسبر

تتكون منطقة كريسبر من تكرارات تسلسلات النيوكليوتيدات المتناظرة والمتباعدة بشكل منتظم، والتي يوجد بينها بتر صغيرة وفريدة من الحمض النووي الفاصل.

ويجدر الذكر حتى هنالك عدة أنواع من أنظمة كريسبر تختلف باختلاف نوع البكتيريا، لذا فيمكن حتى يختلف هجريب تسلسل كريسبر وأنزيماته وطريقة نسخ الـcrRNA من نوع لآخر.

تشتمل منطقة كريسبر على منطقة محفز promoter لضمان حتى منطقة كريسبر يمكن قراءتها وترجمتها إلى CRISPR-RNA (أوcrRNA) الذي تستخدمه الأنزيمات المتعلقة بكريسبر cas proteins في التعهد على الهدف.

يتبع المحفز تكرارات قصيرة short repeats بينها فواصل فريدة spacers:

فأمّا التكرارات repeats تكون موجودة في الحمض النووي البكتيري أصلاً، ويتم نسخها كالجزء الثابت من الـcrRNA. هي أجزاء أطول، عادة ما يتراوح طولها ما بين 28 إلى 37 زوجاً قاعدياً، لكن يمكن حتى تكون أقصر أوأطول من ذلك. بعض تكرارات كريسبر تكون على هيئة تسلسلات متناظرة (بالإنجليزية: Palindromic sequences) أي حتى جميع سلسلة من سلسلتي الـDNA تحتوي تسلسل من النيوكليوتيدات بحيث أنه إذا كان ذلك التسلسل يُقرأ من النهاية 5' إلى 3' في إحدى السلسلتين فإنهقد يكون متطابقا تماما إذا قُرئ من النهاية 5' إلى 3' في السلسلة المحدثة واللتان تشكلان معا اللولب المزدوج للـDNA. هذا التسلسل المتناظر يعني أنه ينسخ RNA ذوترابط قاعدي، فيكون شريط RNA مطوياً ذوشكل ثابت فعال، على شكل حلقة جذعية stem-loop تساعد في تعهد أنزيمات cas عليه. بينما هجربت بعض تكرارات كريسبر بحيثقد يكون RNA الناتج غير مطوي على شكل محدد.

وأمّا الفواصل spacers فهي الأجزاء التي تمت إضافتها من الحمض النووي الفيروسي المهاجِم، ويتم نسخها كالجزء المتغير من الـcrRNA الذي يتصل بالأنزيم cas9، وهوالذي يستخدم في التعهد على DNA المطابق. طولها كـDNA عادة ما يقع بين 32 و38 زوجاً قاعدياً (لكنه يتراوح ما بين 21 إلى 72 زوج قاعدي). وقد تظهر فواصل جديدة خلال مدة قصيرة كجزء من الاستجابة المناعية للهجوم الفيروسي على البكتيريا.

وعادة ماقد يكون هنالك أقل من 50 وحدة من تسلسل "تكرار-فاصل" في منطقة كريسبر واحدة.

توجد جينات أخرى مجاورة لكريسبر معروفة باسم الجينات المتعلقة بكريسبر cas genes، والتي تحتوي على الشيفرة اللازمة لبناء البروتينات المتعلقة بكريسبر cas proteins - والتي من ضمنها أنزيم cas9. يتبع تسلسل CRISPR والفواصل منطقة لبناء جزيء RNA يعهد باسم tracrRNA، والذي يرشد جزيئات البتر وcrRNA إلى مواقعها المستهدفة على DNA.

أي أنه، في الطبيعة، يتكون RNA الكلي الذي يتصل بأنزيم cas9 من هذين الجزأين: الجزء الثابت الذي لا يتغير بتغير الهدف، بحسب بعض المصادر يسمى tracrRNA، (وبعضها الآخر يعتبره جزءاً من crRNA) وله دور آخر في البكتيريا في تكوين الجزء المتغير والمشابه لحمض الفيروس النووي، والذي يسمى crRNA، وهذا الثاني يستخدمه الأنزيم في التعهد على الهدف ويتكون من 20 نيوكليوتيد تقريباً. عادة ما يكوّنان الجزء الثابت والجزء المتغير معاً guide RNA الدليل أوgRNA اختصارا، وهذه التسمية (gRNA) عادة ما تطلق على RNA المصنع لا البكتيري الذي يطلق عليه فقط crRNA.

تقنية كريسبر-كاس في التعديل الوراثي

سخر الفهماء نظام كريسبر الموجود في البكتيريا أصلا، للتعديل على الجينوم لأي نوع من الكائنات الحية، عن طريق قص جزء معين من الحمض الوراثي DNA الخاص بها بدقة لإزالة جينات مسؤولة عن إظهار صفة وراثية غير مرغوبة في الكائن الحي، أواستبدالها بجينات أخرى.

مكونات تقنية كريسبر

هناك مكونان رئيسيان في نظام كريسبر- كاس9 وهما:

1. بروتين cas9، أوCRISPR associated proteinتسعة وهونيوكلييز داخلي غير متخصص يقوم بقص سلسلتي الحمض النووي DNA مثل مقص جزيئي، ويتجه للمنطقة المراد القص عندها اعتمادا على gRNA الذي يحمله وعلى عوامل أخرى مثل توفر تسلسل خاص للتعهد في DNA يسمى PAM sequence.
2. جزيء guide RNA، الحمض النووي الريبوزي الدليل (أوgRNA اختصارا)، يعمل كدليل لتوجيه أنزيم cas9 نحوتسلسل معين من الحمض النووي ليقوم بالقص عند تلك المنطقة. الجزء المتغير من gRNA يتكون من 20 نيوكليوتيدة تقريباً، هذا الجزءقد يكون مطابقاً للشيفرة الوراثية المراد القص عندها لذا يستخدمه أنزيم cas9 في التعهد على المنطقة الهدف من الجينوم.

كما تكمن الباحثون من إجراء إضافات إلى نظام كريسبر-كاس9 تمكنه من أداء وظائف أخرى مكملة غير البتر، فأمكن أيضاً باستخدامها هجريب جينات جديدة مسوؤلة عن إظهار صفات مرغوبة لتحل محل التي تم قصها، وذلك عن طريق تسخير إنزيمات ترميم repair enzymes لتقوم ببناء الجين المرغوب بدلا من الترميم الطبيعي الذي تقوم به الخلية. لذلك، على سبيل المثال، يمكن للفهماء حتى يمكّنوا إنزيم cas9 من حتى يتخلص من الجين الذي يسبب سقم هنتنغتون ثم حتى يستبدلوه بجين أفضل ليحل محله. ويوجد أنزيمات بتر أخرى متعلقة بكريسبر غير cas9 لها ميزات أخرى.

شروط البتر عند تسلسل معين

1. أنقد يكون التسلسل الهدف المكون من ~20 نيوكليوتايد فريداً لا يتكرر مقارنة بباقي الجينوم.
2. أن تكون المنطقة المستهدفة للبتر موجودة مباشرة بالقرب من تتابع خاص مكون من 2-6 نيوكليوتيدات ويسمى (Protospacer Adjacent Motif :PAM). لن يبتر cas9 دون وجود هذا التتابع، وهوذودور مهم في البكتيريا؛ لأنه موجود في الحمض النووي الخاص بالفيروس أوالبلازميد المهاجم وغير موجود في تسلسل كريسبر البكتيري، ما يجنب أنزيم cas9 من بتر التسلسل البكتيري.

الفرق بين كريسبر-كاس وباقي أدوات التعديل الجيني

هنالك فرق رئيسي يميز استخدام تقنية كريسبر عن تقنيات الهندسة الوراثية الأخرى كـأنزيمات البتر: فكل إنزيم بتر يمكنه القص عند تتابع محدد واحد، كما في إنزيم EcoR1 الذي يتعهد فقط على التتابع GAATTC، ما يقيد التعديل الوراثي. بينما يمكن باستخدام تقنية كريسبر البتر عند أي منطقة مرغوبة من الجينوم، وذلك لأن الـ gRNA الذي يستخدمه إنزيم cas9 للتعهد على منطقة البتر قابل للتعديل والهجريب، فعندما يريد الفهماء القص عند تتابع معين من الـDNA فإنهم يصطنعون gRNA مماثل وفريد لهذا التتابع. هذا وفر دقة كبيرة وخيارات أكثر لمناطق بتر الجينوم والتعديل عليه. كذلك عثر حتى تقنية كريسبر نجح تطبيقها على جينوم أي كائن حي تم تجريبها عليه، أما أنزيمات البتر تتعهد على تتابعات موجودة في عدد محدود من الكائنات الحية.

تطبيقات

ما زال الفهماء يحاولون تطوير حل لمشكلة صعوبة التعديل الجيني على خلايا بشرية كاملة، لكن حتى الآن يمكن إجراء تعديلات بسهولة على الخلايا الجذعية وخلايا الدم الحمراء أوعلى خلايا نامية في أطباق بتري.

• تستخدم تقنية كريسبر-كاس9 بكثرة في مجال البحث الطبي، حيث يمكن من خلال تعطيل جينات مختلفة اكتشاف كيف من الممكن أن تؤثر هذه الجينات على مسار الأمراض المعقدة كالزهايمر أوالسرطان، مثلا.
• كريسبر-كاس9 أداة أساسية في تقنية الإجبار الجيني (بالإنجليزية: Gene Drive)، والتي يستخدمها الباحثون حاليا في خطة للقضاء على سقم الملاريا، وذلك بجعل البعوض المعدل وراثياً ليمتلك صفة مقاومة حمل السقم ينشر هذه الصفة بشكل كلي في الأجيال اللاحقة عند تزاوجه مع البعوض غير المقاوِم لحمل السقم، عن طريق جعل احتمال توريث صفة مقاومة السقم بنسبة 100% في الأجيال الناتجة بدلا عن قوانين مندل الطبيعية والتيقد يكون فيها احتمال توريث الصفة بنسبة 50% بالمتوسط.
• تعمل معاهد فهمية في سويسرا على استخدام كريسبر في علاج أمراض الدم الوراثية كسقم الأنيميا المنجلية والثلاسيميا، ونطقت بأنها تمكنت من علاج مصاب بالثلاسيميا من نوع B باستخدام كريسبر.
• بعدما تمت عمليات بنجاح في قص الجينات في الصين والولايات المتحدة قام باحثون من بريطانيا بقص مورثات بأجنة بشرية بواسطة كريسبر- كاس9 وغيروا بعضها. أراد الباحثون من معهد فرانسيس كريك في لندن بهذه الطريقة استكشاف التطور المبدئي الذي يحدث في الأجنة وفهمها بطريقة أفضل؛ بحيث يتوصلون إلى نسبة نجاح أفضل عند القيام بالتخصيب الإصطناعي. يعتبر هذا تدخل من الإنسان في تغيير الخلق، ولهذا فإن الفهماء لم يغرسوا خلاياهم التي قاموا بتغييرات فيها في ارحمام نساء، وإنما أهلكوها. هناك مناقشات كثيرة تجري بين الأطباء والباحثين والسياسيين والقانونيين والمفكرين في شأن بحوث مثل تلك على الإنسان؛ في ألمانيا تلك الأبحاث ممنوعة.
• عام 2018، ادعى عالم صيني يُدعى خه جيان كوي تطبيقه للتقنية على خلايا أجنة بشرية وغرسها في رحم الأم قبل حتى تولد الأجنة التوأم "لولو" و"نانا"، حيث قام بتعديل الشيفرة الوراثية الخاصة بهما لتصبحا مقاومتين لـفيروس HIV المسبب لسقم الإيدز وذلك عن طريق استخدامه تقنية كريسبر في تعطيل الجين المنتج للمستقبل البروتيني CCR5 الذي لوحظ حتى الأشخاص الذين تفتقر بنيتهم الوراثية إلى الشكل الوظيفي لهذا المستقبل ينزعون ليكونوا مقاومين بشكل غير اعتيادي لسقم الإيدز وفيروس HIV، ما أحدث ضجة كبيرة في الأوساط الفهمية لأسباب أخلاقية.

انظر أيضا

• دراسات كريسبر نتائج مشوشة من أبحاث الجينات القديمة
• محرك الجينات
• البروتين المرتبط بكريسبر 9
• تعديل كريسبر

مراجع